限制性核酸内切酶的命名和类型

1、第二章基因工程的酶基础，第一节限制性内切酶第二节DNA结合酶第三节DNA聚合酶和逆转录酶第四节DNA修饰酶第五节体外核酸酶第六节单链内切核酸酶第七节RNA酶，核酸酶：通过切断相邻两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，核酸分子多核酸链中可能发生水解断裂的蛋白酶。基本概念和生物学功能，破RNA分子的特定水解，破DNA分子，破DNA(脱氧核糖核酸酶)非特异性酶，基质或DNA，核酸分子末端逐个分解核苷酸的RNA分子，恩切核酸酶在核酸分子中切断磷酸二酯键，分裂称为小片段所以这些酶叫做工具酶。工具酶，1，限制性-修饰系统2，限制性核酸内切酶的命名和类型3，2型限制性核酸内切酶的基本特性4，影响限制性内切酶活性的

2、因素5，限制性内切酶的DNA消化效果，第一节限制性核酸内切酶，限制性内切酶，限制性核酸内切概念，2 .特性，土产酶主要来自原核生物，即核酸分子链内部制造切口的酶。5-P和3-OH的末端形成，自我保护效果，3 .功能、细菌限制和修复系统(R/M系统)、1 .源，任何生物都有防御外部物质进入的机制，大肠杆菌b，大肠杆菌K，phage (b)，EOP=10-4(限制作用)，EOP=10-4(限制作用)宿主控制的限制和修正被简称为R/M系统。细菌的R/M系统与免疫系统相似，可以区分自己的DNA和外来的DNA，分解后者。宿主的限制和修正现象，E.O.P斑点形成速度efficiency of platin

3、g，EOP=1，限制性内切酶分解侵入细菌的外源DNA，将其切成小块。(1)限制，限制效果：实际上是限制外源DNA的分解和保护宿主遗传稳定性的酶。细菌自身的DNA碱基受甲基化酶甲基化修饰的保护，不会被自身限制性内切酶识别切断。(2)受精(modification)，dam甲基化酶(DNA Adenine Methylase)，GATC腺嘌呤N6位置处的甲基，Dcm甲基化酶(DNA cytosine Methylase)，(3)与受精系统相关的三个基因限制，HSD R:编码限制焓、HSD M:编码限制甲基化酶、HSD S:编码限制焓和甲基化酶的配合表达，识别DNA分子的特定部位，在DNA的特定部位

4、进行碱甲基化，即起受精DNA作用的双链DNA其作用是与上述两种酶合作识别特殊的作用部位。2 .噬菌体是大肠杆菌宿主细胞k株，b株，1)宿主细胞甲基化酶，染色体DNA和噬菌体DNA特异性保护。2)自身产生的核酸内切酶的识别部位-(修饰)，1。大肠杆菌宿主细胞k株，b株，有自己的限制和修改体系。限制和修改作用的分子机制，3 .外来DNA入侵时，受宿主限制的恩赛拉酶的特定分解-(限制)，4 .由于不完全分解，外来少数DNA分子在宿主细胞繁殖期间被宿主细胞的甲基化酶转化，但外部不分解。5在接受新宿主细菌甲基化变异的同时，失去了转化为原宿主细菌的标记，失去了在原宿主细胞中的生存能力。基因工程必须采用没有

5、限制效果的菌株作为受体。1，限制性-修饰系统2，限制性核酸内切酶的命名和类型3，II限制性核酸内切酶的基本特性4，限制性内切酶活性影响因素5，限制性内切酶DNA的消化作用，第一节限制性核酸内切酶，1973年H . O Smith和d . nanah限制性内切酶的命名法，其名称的第一个字母和宗名的前两个字母组成三个字母的缩写，意思是宿主细菌的宗名，构成酶的基本名称。Escherichia coli(Escherichia coli)表示为Eco嗜血流感(Haemophilus influenzae)用Hin说。2.如果酶存在于特殊菌株中，将该菌株名称的第一个字母贴在基本名称后，如果酶的编码基因在

6、噬菌体(病毒)或质粒中，则用一个大写字母标记该染色体外的遗传成分。(如hind: d菌株EcoR I:耐药性r质粒，3 .如果特定菌株有多种限制和修复系统，用罗马文字标记在该菌株中发现特定酶的顺序。Hind: d菌株中发现的第二种酶，4。所有限制性内切酶除了上面的名字外，还加上系统的名字。限制性内切酶系统被命名为r，甲基化酶m。例如，R.Hind表示在相应甲基化酶的实际应用中经常省略R。EcoR I，Escherichia，属名，Coli，宗名，Ry13，主，号，宗名的前两个字母相同时，可以使用的宗名的第一个和第三个字母之一。目前已确认了4种类型的限制日元也是核酸酶。根据限制性核酸内切酶的识别

7、切割特性、催化条件以及是否有修饰酶活性，可以分为，类型。限制性内切酶类型，第二，限制性内切酶识别切割特性，根据催化条件和修饰酶活性，可以分为类型，用于基因工程，注：SAM是s腺苷蛋氨酸，首先从M.Meselson和R . Yuan 1968年大肠杆菌b组和k菌株中分离出来。(1)识别的站点序列，EcoB:TGA(n)8 tgct EcoK:AAC(n)6 gtgc，类型限制存储模块的基本属性，例如EcoB和EcoK。未甲基化的修改后的特定顺序。n:指示需要什么样的核苷酸。ATP、Mg2和SAM(S-腺苷蛋氨酸)，(3)辅助因子在特定识别部位随机切割约10001500 BP的单链，不生成特定片段

8、，应用不多，Recognize site，cut，分离的第一种酶是Hind未甲基化的修改后的双链DNA中的特殊目标序列(大部分是回文序列)，与DNA的来源无关。A B N B A，A B N B A，或限制土卫二的基本特性，(1)标识站点序列，标识站点位置。切割双股DNA。形成“粘性末端”(sticky end)或“平面末端”(blunt end)。例如，(2)剪切部分，a g c t，t c g a，ecop 1: aga cc、ecop 15: CAG很少用于基因工程工作。类型限制恩多核酸酶的基本特性，IV限制恩多核酸酶。碱仅切断甲基化、羟甲基化、葡萄糖羟甲基化DNA序列。除EcoKMcr

9、BC外，标识序列尚未确定，当前尚未应用。，核酸限制性内切酶的类型和主要特性，1，限制性-修饰系统2，限制性核酸内切酶的命名和类型3，2型限制性核酸内切酶的基本特性4，影响限制性内切酶活性的因素5，对DNA的限制性内切酶的消化，第一节限制性核酸内切酶，识别序列，4bp HPA c CGG hae gg cc 5b pava g gwcc ecor CCW gg 6bp bamhg gattc smaccc GGG 11bp bg1 gcc nnnn nggc 12bp bstx ccan nnnn ntgc，1，以一对核苷酸为中心轴，左侧和左侧2，如果把这两条DNA链读在同一方向(例如5 3)，

10、那么核苷酸的顺序是相同的。5GAA TTC3 3CTT AAG5，2:回文顺序：反向重复顺序，双链DNA中包含相同结构的两个相反方向序列，5GTNAC3 3CANTG5，限制性核酸内切酶切断双链DNA，磷酸二酯键中3位数酯键的歌手，切割方法，与2型核酸内切相关的一些概念，粘性末端：是酶切割部位在两个DNA单链上由不同(对称)酶切割部位形成的互补碱基的单链末端结构，通过酶产生的两个粘性互补碱基对可以很容易地重新连接。“平端”(Blunt end):是酶切部位在两条DNA单链上相同，因此在酶切后形成的平端结构，该端不易重新连接。1 .5挤出终点，2。3挤出端，I)其他DNA双链：只需连接粘性端基本

11、互补。比连接两个平端容易得多。粘性末端的意思，便利的连接，ii)在同一DNA分子内的连接：可以通过两个相同的粘性末端连接成环状分子。粘性末端可以用DNA聚合酶制造平端。通过末端过渡酶可以添加多个多核苷酸的尾部(如dA和dT)，B 3末端可以由均聚物和尾部人工粘着。A 5端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。显示末端，3 .只有1%的平头端、平头端特征、连接困难、连接效率低、粘性端连接效率高，这种连接经常出现多连接连接。粘性末端和扁平末端连接处理方法，)添加方法：使用DNA聚合酶(klenow fragment)将碱基添加到目标基因的粘性末端。)萨克(平)方法使用诸如S1和Bal31的核酸酶，

12、在目标基因粘着端切割单股突起，以识别平端、不同来源的酶、相同序列，以相同的方式切割或不同地切割。识别部位和触点完全相同Hind和hsu I，Hind 5-AAG CTT-3-TTC GAA-5 hsu I 5-AAG CTT-3-TTC GAA-5，Isoschizomer，完全相同Xma I和Sma I。不完整的异烟肼：识别的顺序不同，但可以切割相同的粘性末端。5-gg ATCC-3-cc tagg-5、bamh I、bcl I、5-TG atca-3-acta gt-5，如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho等y表示笛米丁。isocaudamers，5-gatc - 3 - ctag-

13、5，sau 3a，同一尾酶的粘端相互结合形成的新部位，一般不再被识别为原酶。5-g 3-cctcag、ga TCT-3 a-5、bamh I、bgl、5-gg atct-3-cc taga-5、bamh I、bamh标准酶水解系统的建立，1个单位(u)的限制性内切酶的定义：在适当的温度和缓冲液中，1h完全酶水解1gDNA所需的酶量。推荐：稍微过剩的酶(2-5倍)，反应时间长，限制性核酸内切酶的反应条件，2。通过酶解过程、酶解系统混合反应，结束酶解结果识别，将总反应体积最小化，只要酶解系统、一般20l、酶解液体积不超过反应总体积的10%。样品顺序一般是ddH2O buffer DNA酶，大部分2

14、型核酸内质酶需要类似的反应条件：混合，吸管吹制或手指经胆管壁，如果基质分子大(例如基因组DNA)，应避免强烈震动。混合微高速离心机，施加短暂的瞬态离心力，使管壁液体全部下沉。反应终止，三种方法：)加乙二胺四乙酸(EDTA)全浓度10mol/l；十二烷基硫酸钠(SDS)的总浓度为0.1%(W/V)，65加热20min或70加热10min，)苯酚/氯仿萃取，酶水解结果确认，微琼脂糖凝胶电泳快速观察后，决定反应是否结束，限制性核酸内切酶的反应局部消化：只切除了有限数量的酶部位。缩短保温时间，降低反应温度或减少酶用量，达到局部消化目的。酶切后发现，除了目的DNA条外，还存在其他引起非特异性切的条；错误的操作导致了其他日元也有核酸酶污染。气质DNA可能有其他DNA污染。电泳后电泳条扩散，电泳条移动距离异常，基质DNA不纯；恩多纽克莱亚泽不纯；酶蛋白本身或其他杂蛋白与DNA结合，电泳带异常远地移动，蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA、NaCl等DNA中的杂