生物技术与食品产业PPT课件.ppt

1、第二章 基因工程与食品科学,概述 基因工程定义 是指按人们的需要，用类似工程设计的方法将不同来源的基因（DNA分子），在体外构建杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录和表达的操作。又称为DNA重组技术。 基因工程的实施包括四个必要的条件：工具酶、基因、载体和受体,1,基因工程的内容和方法 主要内容： 分离制取带有目的基因的DNA片段；在体外，将目的基因连接到行当的载体上；将重组的DNA分子导入受体细胞并扩增繁殖；从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的重组体；外源基因的表达和产物的分离和纯化。,2,主要方法 密度梯度离心；DNA分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝

2、胶电泳、细胞转化、DNA序列结构分析以及人工合成、基因定点突变和PCR扩增等多种新技术、新方法。,3,基因工程的分子生物学基础 脱氧核糖核酸 DNA变性、复性和杂交 DNA的复制 DNA的修复 生物的基因重组 基因 遗传信息的传递方向,4,脱氧核糖核酸 生物的遗传物质是DNA。DNA是由大量的脱氧核糖核苷酸组成的线状或环状生物大分子。由碱基、磷酸、戊糖组成。碱基由腺嘌噙（A）、鸟嘌噙（G）、胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）组成。,5,DNA变性、复性与杂交 DNA变性（DNA denaturation）：在高温及强碱长期保持下，双链DNA分子氢键断裂，两条链完全分离，形成单DNA分子。 复性（re

3、naturation）或退火(annealing)：变性DNA分子经处理又可重新形成天然DNA分子，这个过程称。降低温度、pH及增加盐浓度均可促进DNA的复性。 杂交（hybridization）:当复性DNA分子由不同的两条链分子形成时，这种复性称为。,6,DNA的复制 复制是一个复杂的过程，可参看有关书籍。 DNA复制特点：从特定的开始并按特定的方向进行（53）；DNA分子的复性是半保留复制；DNA分子的复制是半不连续复制；DNA分子的复制是通过DNA聚合酶及各种相关的酶蛋白、蛋白因子的协同有序的工作完成的；DNA分子复制具有高度的精确性和准确性 DNA分子复制的速度：细菌：104105核

4、苷酸/min，而在真核细胞中为5005000核苷酸/min,7,DNA的修复 DNA复制时可能由于DNA聚合酶引发的偶然的错误，或者由于环境因素致使DNA产生序列上的错误，此时生物体内存在着的修复系统就会对DNA的变异起保护修复的作用。 DNA修复主要包括三个步骤： DNA修复核酸酶对DNA双链上不正常的碱基的识别与切割；DNA聚合酶对已切割区域的重新合成；DNA连接酶对剩下切口的修补,8,基因 基因是具有遗传疚的DNA片段，也是编码蛋白质或RNA分子遗传信息的基本遗传单位。 2001.2.12由美、中、日、英、法等国宣布人类基因组草图完成，人类基因组由31.67亿个碱基组成，共有3万个左右基

5、因 现代研究表明：基因是一个功能单位，但不是一个不可分割的的最小的重组单位和突变单位，它包含若干个空谈子和重组子。,9,移动基因（movable gene）：是指一个或以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位置，甚至在不同的染色体之间跃迁，故也称为跳跃基因。但这种移动只是移动一个拷贝，在原来的位置还保留一份拷贝。 断裂基因（split gene; interrupted gene）：基因编码序列中有与氨基酸编码无关的DNA间隔序列，使一个基因分隔成不连续的若干区段。这种编码序列不连续的间断基因称为。,10,断裂基因的表达程序是：先转录成初级转录物，又叫前体mRNA，然后经过删除和连接，除去无

6、关的DNA间隔序列的转录物，便形成了成熟的mRNA分子；它从细胞核中输送到细胞质，再译成相应有多肽链。其中被剪除的DNA部分叫间隔序列或内含子（intron），被保留下来的DNA部分叫编码序列或外显子（exon）。这种内含子的除和外显子的连接，形成成熟的mRNA的过程，称为RNA剪接。,11,假基因（pseudo gene）在真核生物中普遍存在。这是一类在基因中稳定存在，核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同、但却不能合成出有功能的蛋白质的失活基因，它是相应的正常基因空谈而丧失活性的结果。人类基因中与蛋白质合成有关的基因只占整个人类基因组的2%。,12,重复序列（repeated seque

7、nce）：是指在一个DNA分子中出现不止一次的序列。 几乎所有的真核生物的基因组DNA中都有重复序列。在人类基因组计划中发现，35.3%的基因组包含重复序列。,13,重叠基因（overlapping gene）：是指一个基因的序列中，含有另一个基因的部分或全部序列，即其核苷酸序列是重叠的。基因重叠现象仅发现于一些噬菌和病毒基因组中。,14,中心法则 转录 翻译 DNA RNA 蛋白质 反转录,15,基 因 重 组 目的基因与载体基因，标记基因等的连接叫基因重组 重组质粒基因包括：,标记片段,启动子,目的基因,终止子,载 体 基 因 片 段,16,基因工程的一般操作步骤 目的基因的获得 载体的选

8、择 重组质粒的构建 导入目标生物体细胞内 转基因重组体的获得 转基因生物的鉴定,17,基 因 工 程 的 特 点 生物的基因可以在人类、动物、植物和微生物四大系统间进行交流 可以大大缩短育种年限。 变异可以定向,18,基因工程的基本原理和内容一、基本概念,染色体 DNA（脱氧核糖核酸） RNA（核糖核酸） 基因 中心法则,19,20,1、DNA分子是由两条互相平行的脱氧核苷酸长链盘绕而成的。2、DNA分子中的脱氧核糖和磷酸交替连接，排在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧。3、两条链上的碱基通过氢键相结合，形成碱基对，它的组成有一定的规律。,21,人类染色体组示意图,22,细胞核示意图,23,动

9、物细胞示意图,24,植物细胞示意图,25,DNA（脱氧核糖核酸）,由两条极性相反并互补的多聚核苷酸链围绕中心轴的双螺旋结构。 两条链中的碱基之间按照A配T,G配C的互补原则，以氢键连接。 其中A为：腺嘌呤 T为：胸腺嘧啶 G为：鸟嘌呤 C为：胞嘧啶 U为：尿嘧啶 (RNA) DNA 直线排列于染色体上，存在于细胞核中。 DNA有自我复制的能力。,26,DNA自我复制示意图,27,DNA双螺旋碱基配对图,28,RNA（核糖核酸）,存在于细胞质中 分别有三种功能不同的RNA rRNA tRNA rRNA mRNA为遗传密码，由DNA转录而来,29,有关基因的概念,基因是含有一定功能的DNA片段，是

10、遗传的基本单位。 获取某段有一定生理功能的DNA片段叫基因克隆。 找出某段有一定生理功能的DNA片段在染色体上的位置叫基因定位。 测定出某段有一定生理功能的DNA片段的碱基序列叫基因测序。 按照一定的碱基序列，以核苷酸为原料，合成某段有一定生理功能的DNA片段叫基因合成。,30,基因工程研究的对象,研究生物大分子，如：蛋白质、核酸、多糖等调节生命过程的物质，包括它们的结构、性状、代谢。 分子生物学是基因工程的基础。,31,工具酶,三大类： 限制性内切酶 连接酶 修饰酶,32,Restriction enzymes( recognize specific short sequences of D

11、NA and cleave the duplex (sometimes at target site, sometimes elsewhere, depending on type).识别序列常是一组含4-6个核苷酸的回文序列.是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶Restriction map is a linear array of sites on DNA cleaved by various restriction enzymes.DNA限制酶切片段沿染色体或染色体片段的依次排列称作限制图谱.,33,限制性核酸内切酶的命名,按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字

12、母大写与种名的头两个字母小写组成的三个斜体字母作略语表示； 如有株名，再加上一个字母； 其后用大写罗马数码、区分同菌株种内具有的不同限制性修饰系统 。 例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为Hind、Hind和HindIII。 BamH Cla I EcoR Hind III,34,限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease） 识别DNA的特异序列，并在识别位 点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 是细菌内存在的保护性酶。分为I、II、III三类。,限制性核酸内切酶的分类,35,II类酶识别序

13、列特点为回文结构。 GGATCC CCTAGG ,36,三、限制性内切酶的切割位点,大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5磷酸基和3羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同,37,38,限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：钝性末端(blunt end/flush end) 粘性末端(sticky end/cohesive end ),39,5-端突出 粘性末端 3-端突出 限制性核酸内切酶识别序列长度为48个bp。 不同酶切产生的相同粘性末端称配伍末端（compatible end），可用连接酶连接。,40,A B C,41,Restrict

14、ion Nucleases,42,Restriction Nucleases,43,不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同。有的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。 如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp（44）出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4096bp(46)或65,536bp(48)出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。 限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近800多种，可以根据它们对DNA有不同的识别

15、序列和切割特征选用，从而为基因工程提供了有力的工具。表列出了几种最常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点。,44,几种最常用的限制性核酸内切酶,45,同裂酶（isoschizomers）:有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶位点序列，这类酶称为同裂酶。/异源同工酶 也用于分析甲基化 HpaII和MspI 均识别CCGG，其中*表示甲基化。甲基化后HpaII不可切，而MspI可以。 同尾酶（isocaudamer）:一些来源不同的限制酶，识别的是不同的核苷酸靶位点序列，但是产生相同的粘性末端。这类没酶称为同尾酶。 如 BamH I GGATCC Bcl I TGATCA Bgl II

16、AGATCT Xho II UGATCY U嘌呤 Y 嘧啶,几个相关概念,*,46,限制性内切酶,是一类能识别和切割双链DNA分子中的某特定核苷核酸序列的酶 ,47,限制性内切酶的类型及其特征,48,49,Figure 2.1 DNA can be cleaved by restriction enzymes into fragments that can be separated by gel electrophoresis.,50,Figure 2.2 Double digests define the cleavage positions of one enzyme with regar

17、d to the other.,51,Figure 2.3 A restriction map can be constructed by relating the A-fragments and B-fragments through the overlaps seen with double digest fragments.,52,Figure 2.5 A restriction map is a linear sequence of sites separated by defined distances on DNA. The map identifies the sites cle

18、aved by enzymes A and B, as defined by the individual fragments produced by the single and double digests.,Genes can be mapped by restriction cleavage,53,Four alleles for a restriction marker are found in all possible pairwise combinations, and segregate independently at each generation. Photograph

19、kindly provided by Ray White.,54,Figure 2.6A point mutation that affects a restriction site is detected by a difference in restriction fragments.,How variable are individual genomes?,55,Figure 2.9 If a restriction marker is associated with a phenotypic characteristic, the restriction site must be lo

20、cated near the gene responsible for the phenotype.,The mutation changing the band that is common in normal people into the band that is common in patients is very closely linked to the disease gene.,56,其他重要的酶,一、核酸酶 Nuclease * 1. 外切酶 exounclease 2. 内切酶 endonuclease 二、连接酶(Ligase) 三、聚合酶 polymerase 四、DN

21、A修饰酶modifying enzyme 1. 碱性磷酸酶 2. 寡核苷酸激酶 3. 末端脱氧核苷酸转移酶 五、拓特异构酶,57,核酸酶(nucleases)是指所有可以 水解核酸的酶。 按底物不同分为： DNA酶（DNase ）* RNA酶（RNase ）,一、核酸酶 Nuclease *,58,按作用部位不同分为： 5末端外切酶 核酸外切酶 3末端外切酶 核酸内切酶 限制性核酸内切酶：* 有严格的序列依赖性，是基因工 程中的重要工具酶。,59,核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来； 核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3，5

22、磷酸二酯键，将核酸链切断。 很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制-修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。,60,61,核酸外切酶,exonuclease(E.coli) 只从一条

23、DNA的3端外切 DNase I 对双链和单链DNA都进行剪切，在双链DNA上产生随机切口 RNaseH 特异性降解RNA-DNA杂交分子中的RNA链，cDNA中二链的合成 单链核酸内切酶 BAL31 攻击5和3的核苷酸。双链外切活性与单链内切活性 S1 endonuclease(tungus Aspergillus oryzae) 只攻击单链DNA，包括双链中的单链,62,二、连接酶(Ligase),将核酸分接在一起，需要ATP供能。 1）封闭作用 2）连接两个分子,63,连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP

24、。,四、DNA连接酶（DNA ligase）,ATP,64,DNA连接酶在复制、DNA修复、 重组、剪接中均起缝合缺口作用。 是重要的工具酶之一。,65,66,DNA Ligase,67,Insert DNA Fragment into a vector,68,三、聚合酶 polymerase,复制合成新的DNA链，合成方向53端。多数聚合酶都有35的外切酶活性，每次以切除一个核苷酸的速度，在无dNTP存在情况下，可以对单链或双链3OH端作用，但在dNTP情况下，对于双链DNA聚合活性将抑制外切酶活性。 对于一些DNA聚合酶如E.coli.DNA polymerase，也有53外切酶活性，一次

25、可以切出一个至10个核苷酸。这个外切酶活性是发生在合成之前即前面切除，后面马上又合成，这反应就是缺口平移(nick translation) 53外切活性位于分子的N端，可以通过蛋白酶或缺失基因而除去。结果剩下的聚合酶保留了合成和35外切酶活性，它就是Klenow fragment(或全称为E.coli DNA pol large fragment)。 这些都是DNADependent DNA polynerase。 如果是RNA Dependent DNA polyneraseReverse transcriptase 鸟类骨髓母细胞瘤病毒（AMV） T4 DNA polymerse 单个多

26、肽分子112,1000，对单链和双链有很强35外切酶活性并缺乏53外切活性。它与Klenow都可以将双链突出端的DNA转变成钝端，但功能不一样，可以标记平端甚至3突出。,69,DNA聚合酶,催化dNTP聚合到核酸链上的酶。是DNA复制的主要酶。 全称叫依赖DNA的DNA聚合酶（DNA dependent DNA polymerase）或DNA指 导的DNA聚合酶（DNA-directed DNA polymerase），均缩写为DDDP。,70,(一) DNA聚合酶催化的反应 1. 5至3的聚合活性 催化四种dNTP一个一个地接到DNA 链上去。 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+

27、1 + PPi,71,聚合反应机理：,72,聚合反应的特点： (1) 以单链DNA为模板 (2) 以dNTP为原料 (3) 引物提供3-OH (4) 聚合方向为53,73,2.核酸外切酶活性,35外切酶活性：切除错配的核苷酸,53外切酶活性： 切除引物切除突变的片段,？,74,(二) DNA聚合酶的种类1. 原核生物的DNA聚合酶,75,DNA-pol I:,单一肽链的大分子 曾被称为复制酶(replicase) 含量最多 可被水解成两个片段 小片段(N端)：具有53外切酶活性； 大片段(C端)：具有聚合活性和35 外切酶活性，也称为Klenow片段，是常用的工具酶。,76,DNA-pol I

28、II: 由10种亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高,77,2. 真核生物的DNA聚合酶,DNA-pol 复制中延长随从链 DNA-pol 没有其他pol时才起作用 DNA-pol 催化线粒体DNA的复制 DNA-pol 复制中延长领头链 DNA-pol 校读、修复和填补缺口,78,(三) 复制的保真性(fidelity),至少依赖三种机制： 1. 遵守严格的碱基配对规律； 2. 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能； 3. 复制中的即时校读功能。,79,POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR),DNA to be copied,A C G T nucleotides,DN

29、A polymerase,primer sequence,Taq DNA 聚合酶，耐高温的酶,80,四、DNA修饰酶modifying enzyme,1. 碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase (E.coli 或calf intastinal tissue)将DNA分子5-terninus的磷酸基团移去。 2. 多核苷酸激酶 polynucleotide kinase(E.coli infected with T4 phage)与碱性磷酸酶功能相反，即将磷酸基团加到5自由端。 3. 末端脱氧核苷酸转移酶 Terminal deoxyyaucleotidyl transferas

30、e(calf thynustissue)在DNA分子的3端加上一个或多个脱氧核苷酸，即可以作用于单链也可以是双链。不需要模板。（可用于标记及连接）,81,五、拓特异构酶,属于解旋解链酶类 解开并理顺DNA双链，维持DNA 处于单链状态。主要有解螺旋酶、 DNA拓扑异构酶和单链DNA结合蛋白。,82,(一) 解螺旋酶 (helicase) : 模板对复制的指导作用在于碱基的准确 配对，而碱基却埋在双螺旋的内部。只有把DNA解开成单链，它才能起模板作用。 解螺旋酶是最早发现的与复制有关的蛋 白质，当时称为rep蛋白。作用是利用ATP供 能，解开DNA双链。,83,复制相关蛋白的基因：dna A、d

31、na B、dna C dna X 相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、Dna C Dna X Dna A：辨认复制起始位点 Dna B：解螺旋酶 Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 结 合并打开双链。,84,(二) 单链DNA结合蛋白 (SSB) : SSB曾被称为螺旋反稳定蛋白（HDP）。在大肠杆菌，它是由177个氨基酸残基组成的 同四聚体，结合单链DNA的跨度约32个核苷 酸单位。 SSB与解开的DNA单链紧密结合，防止 重新形成双链，并免受核酸酶降解。在复制 中维持模板处于单链状态。,85,(三) DNA拓扑异构酶 (topoisomerase) :,拓扑：是指物体或图像作

32、弹性移位而又保持物体不变的性质。 拓扑异构酶：是一类可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。可松弛DNA超螺旋，有利于DNA解链。 共价闭环DNA形成或解除超螺旋 covalently-closed-circular DNA,86,87,拓扑异构酶I（topo I）:,在原核生物曾被称为蛋白。 主要作用是切开DNA双链中的一股，使 DNA解链旋转中不打结，DNA变为松弛 状态再封闭切口。,88,拓扑异构酶II（ topo II）:,在原核生物又叫旋转酶(gyrase)。 能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参 与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接 断端。

33、,89,90,限制性内切酶应用,酶切图谱； 基因克隆； RFLPs; 基因组作图,91,酶切图谱,限制性图谱 restriction map定义：描述DNA上限制性内切酶切割位点之间距离和顺序的图谱。,92,Restriction Mapping,Map the order of genes. Use different restriction enzymes individually on same DNA Then use both enzymes together. Run all 3 samples in 3 lanes of a gel. Match up the pieces by

34、 size. Order is revealed.,93,Example of R. Mapping,Use 2 enzymes EcoRI and BamHI EcoRI fragments are 850, 500, and 300 bp BamHI 950, 600, 100 bp Both EcoRI and BamHI 600, 400, 300, 250, 100 bp,94,Restriction Mapping,EcoRI BamHI Both,950 850 600 500 400 300 250 100,95,The Map,100 950 600,500 300850,100 400 300 250 600,BamHI,EcoRI,Both Enzymes,96,The Map,The 600 and 100 bp fragments are created by no EcoRI cut sites within the BamHI restriction si