端粒和端粒酶的发现历程

1、端粒和端粒酶的发现过程辽宁新华介绍2009年，诺贝尔生理学或医学奖授予了UCSF的伊丽莎白布莱克本(利兹)、约翰肖普金斯大学的卡罗尔格雷德(卡罗尔)和霍华德医学院的杰克逊佐斯塔克。诺贝尔奖主页介绍她/他们获奖的原因是为了揭示端粒和端粒酶如何保护染色体？端粒和端粒酶的研究过程贯穿着“发现现象/问题”“提出概念/模型”“实验验证”的思想。整个过程就像一个接一个的解谜一样有趣，充满了精彩的想法。对科学家来说，重现这一想法是有启发性的。本文也为科学问题演绎提供了一个很好的教学案例。染色体末端和端粒概念的两个难题20世纪70年代早期，对DNA聚合酶特性的深入理解导致了染色体复制的问题。复制DNA时，DN

2、A聚合酶必须有引物启动，它的酶活性是定向的，只能沿DNA的5到3方向合成。在染色体复制开始时，小核糖核酸可以作为引物开始合成，然后启动细胞修复机。DNA聚合酶可以用反向链DNA作为模板，用以前合成的DNA作为引物，在染色体中间合成新的DNA，而不是RNA引物。然而，线性染色体末端的核糖核酸引物不能被脱氧核糖核酸取代，因为没有其他引物可以启动。因此，每次线性染色体DNA复制时，一个RNA引物的长度会在RNA引物降解后缩短(图1，简化示意图，事实上，染色体DNA的双链末端不会是平的)。虽然这个引物不长，但千千细胞已经复制了几千代。如果不进行补偿，染色体将会缩短并最终消失。詹姆斯沃森(因发现了脱氧核

3、糖核酸的双螺旋结构而获得诺贝尔奖)最早明确指出了这个“末端收缩问题”，并猜测染色体可能能够通过在复制前连接染色体末端来解决末端复制问题1。早在1939年，致力于玉米遗传特性研究(因发现玉米转座子而获得诺贝尔奖)的巴巴拉姆克林托克就注意到，减数分裂后期意外产生的染色体断裂很容易再次融合形成“桥梁”。在随后的有丝分裂中，染色体“断裂-融合-桥-断裂”的循环持续不断2。既然染色体的断裂末端很容易相互融合，为什么染色体的自然末端不容易相互融合？推测染色体的自然端不同于异常的DNA断裂端是合理的，它应该具有特殊的结构以避免染色体之间的融合。早在1938年，赫尔曼穆勒(因发明X射线突变基因而获得诺贝尔奖)

4、用X射线照射果蝇产生突变体，并注意到染色体末端不同于其他区域。它非常稳定，没有观察到破损或倒置。因此，他预先认为染色体的末端是特殊的，需要被密封并给它一个适当的名字端粒(来自希腊的根端粒，末端和部分端粒)3。端粒DNA序列的发现和人工染色体的发明那么为什么端粒不同呢？简单地说，首先，它的DNA序列有什么特殊性吗？提到端粒，就不能不提一种特殊的模式生物四膜虫。它对发现端粒和端粒酶的贡献与线虫对发现细胞凋亡的贡献相同(2002年，细胞凋亡研究获诺贝尔奖)。四膜虫有两个细胞核。核细胞是稳定的，包含5对染色体，用于生殖传代。然而，在合子细胞的发育过程中，巨核细胞的染色体分裂成200-300条小染色体，

5、而rDNA(包含编码核糖体核糖核酸的基因)从染色体上分裂下来并复制形成多达10，000条小染色体。四膜虫有许多小染色体，这意味着端粒可能非常丰富。这为端粒研究提供了一种独特的材料。1978年，Liz女士用这种特殊的模型对rDNA进行了生物纯化，并通过体外以rDNA为模板合成dNTP的实验，得出结论：四膜虫的端粒是由许多重复的6个碱基序列组成的。第一个谜团解开了，哦，重复序列，端粒DNA真的很特别。序列本身隐含着解决染色体末端收缩和保护问题的机制。1980年，当莉兹女士在会议上报告她的发现时，引起了杰克逊佐斯塔克的极大兴趣。当时，他试图在酵母菌中构建一条人工线性染色体，使其能够像自然染色体一样在

6、细胞中复制。然而，当环状质粒被线性化并转移到酵母细胞中时，它很快被降解。它退化是因为末端没有端粒保护吗？端粒序列的发现给了JackSzostak机会将线性质粒的末端与四膜虫的端粒DNA连接起来，然后将其导入酵母细胞。奇迹发生了，线性质粒不再降解，它可以在细胞中复制，人工染色体的想法实现了！5值得一提的是，人工染色体的实现起初可能只会满足人们的奇思妙想，但它实际上使克隆大片段的DNA成为可能，并在后来对人类基因组测序做出了巨大贡献。这也是杰克逊佐斯塔克一起获得诺贝尔奖的一个重要原因。1984年，利兹实验室将酵母端粒克隆到线性人工染色体中，发现酵母端粒由不规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成5

7、，6。端粒复制的两个假说与端粒酶活性的发现在1984年报道酵母端粒序列的同一篇文章中，Liz实验室发现了一个有趣的现象：在将带有四膜虫端粒DNA的人工染色体引入酵母后，添加了酵母端粒而不是四膜虫端粒序列6。因为端粒是由重复序列组成的，所以人们普遍怀疑同源重组是延长端粒以补偿染色体末端收缩的机制。然而，同源重组只能复制更多的自身序列。为什么酵母端粒序列被添加到四膜虫端粒而不是四膜虫端粒本身？同源重组无法解释这一现象。也许，酵母中有特殊的“酶”来复制端粒DNA。它是重组酶还是全新的酶？为了澄清这两个假设，莉兹意识到最重要的是找到这种“酶”。如前所述，在四膜虫巨核细胞的发育过程中，巨核细胞产生非常丰

8、富的小染色体，每条小染色体都从无到有地添加了端粒。可以推测，如果“酶”的假设成立，此时细胞中“酶”的活性应该很高。1984年，卡罗尔女士作为博士生加入了利兹实验室。他们两人仔细讨论并设计了实验，用四膜虫核提取物体外培养端粒DNA，试图在体外检测这种酶的活性并观察端粒的延伸。经过不断优化条件，特别是用体外合成的高浓度端粒DNA替换底物后，勤奋的卡罗尔学生在同年圣诞节打开暗盒，曝光了x光片，终于清楚地看到了“酶”的活性。在测序凝胶的同位素暴露膜上，端粒底物明显添加了DNA碱基，每六个碱基形成一条深带，与六个碱基的四膜性端粒重复单位相吻合7。这种酶的活性不依赖于DNA模板，只延伸四膜虫和酵母的端粒D

9、NA，而不延伸随机序列的DNA底物；并且该活性独立于DNA聚合酶7。由于同源重组对序列没有特殊要求，并依赖于DNA聚合酶的活性，他们澄清了这两个假设，并证明存在一种“酶”来延伸端粒DNA。这种酶后来被命名为“端粒酶”。端粒酶核糖核酸亚单位的发现然后他们开始进一步描述端粒酶活性。这时，托姆切赫(因发现核糖核酸具有催化酶活性而获得诺贝尔奖)碰巧参观了利兹的实验室。她/他们一起做了一个简单的实验，即用核糖核酸酶处理样品，降解样品的核糖核酸，并观察端粒酶活性是否受到影响。结果，酶活性实际上消失了，端粒酶活性依赖于核糖核酸8，9。端粒酶可能是另一种特殊的核糖核酸催化酶吗？大概从这个时候开始，TomCec

10、h开始被端粒酶深深吸引并介入这个领域。当然，当时也知道端粒酶是蛋白质依赖性的：用蛋白酶消化的样品没有端粒酶活性7。1989年，卡罗尔通过跟踪端粒酶活性，纯化并克隆了四膜虫端粒酶核糖核酸亚单位。另一个谜团已经解开：核糖核酸亚单位有一个核糖核酸序列，它与四膜虫的端粒DNA序列完全互补，端粒酶用这个核糖核酸亚单位序列作为模板，重复复制端粒DNA10。端粒和端粒酶的大多数领导者是女性。公平地说，我们不妨介绍更多的人。弗吉尼亚大学实验室的DanielGottschling发现端粒区域具有TPE效应(端粒位置效应)，也就是说，插入端粒区域的基因将被沉默而不表达11。让我们来看看丹尼尔戈特施林在建立了自己的

11、实验室之后，是如何利用热塑性弹性体现象来设计实验并筛选出酵母的核糖核酸亚单位基因的。与此同时，他还将酵母视为一种非常强大的遗传模式生物。首先，通过基因重组将URA和腺苷酸基因导入端粒区。URA基因使酵母能够自行合成尿嘧啶。缺乏腺苷酸基因会使酵母积累红色素，使酵母克隆变红。由于端粒的TPE效应，URA和ADE不表达，酵母只能在含有尿嘧啶的培养基中生长，克隆是红色的。可以预测，一些调节端粒长度的基因在转移到酵母表达文库中时会通过过表达改变端粒长度。如果端粒长度变得足够短，TPE效应将消失，URA和ADE基因将开始表达。具有短端粒的酵母可以在没有尿嘧啶的培养基中生长，并且酵母克隆显示白色(图2)。利

12、用这两个指标进行筛选，我们可以筛选一系列缩短端粒的基因。其中一个基因是特殊的，任何阅读框只能阅读一个短的蛋白质序列，这看起来更像一个核糖核酸基因。深入研究发现，这种基因包含酵母端粒序列的互补序列，而当这种序列发生突变时，酵母端粒序列也相应发生变化这种基因就是编码酵母端粒酶的核糖核酸亚单位的基因12。这一发现有运气的成分，因为总的来说，端粒是调节基因过度表达的，所以端粒应该延长。相反，端粒酶核糖核酸亚单位的过度表达使端粒变短。此后，在1995年，利兹实验室也报道了酵母端粒酶的活性13。端粒酶催化亚单位的发现在核糖核酸亚单位被发现之前，唯一的谜团是端粒酶的蛋白质亚单位。由于端粒酶可以通过使用核糖核

13、酸模板亚单位复制脱氧核糖核酸，因此很容易推测该蛋白质亚单位可能具有核糖核酸依赖性脱氧核糖核酸聚合酶活性(取决于核糖核酸聚合酶活性)，即逆转录酶活性。此外，其蛋白质序列应包含逆转录酶的特定结构域。虽然没有实验证据，但这个谜的一半已经被逻辑推理所猜测。许多人想彻底揭开它，不同实验室之间的竞争变得非常激烈。1989年，另一位端粒和端粒酶领域的女性杰克逊索达实验室的维克兰布兰德(VickiLundblad)用一种精心设计的遗传筛选方法从酵母中筛选出EST1基因(这种遗传方法比丹尼尔戈特施林(DanielGottschling)的描述更复杂，所以我不在这里介绍，而是饶有兴趣地阅读原始文献)。当EST1基

14、因被敲除时，端粒将随着酵母的通过而逐渐缩短，当端粒最终缩短到一定程度时，酵母将因衰老而死亡14。Est1蛋白与酵母表型中端粒酶的蛋白催化亚单位非常相似。维克伦德布莱德和利兹在1990年的细胞杂志上大胆猜测Est1蛋白含有逆转录酶域15。弗吉尼亚大学实验室也报道了Est1蛋白对于体外酵母端粒酶的活性是必需的16。然而，在顶级杂志上发表的作品不一定是一份好工作，而且在科学中也有谬误，尤其是当竞争激烈的时候，当人们感到接近揭开谜团时，他们会不耐烦，并急于发表一些不可靠的数据。这一次，运气不在他们这边，答案是错误的。那么端粒酶的催化亚单位是什么？1996年，TomCech实验室用生物化学方法纯化了四膜

15、虫端粒酶复合物，其中一种蛋白质根据其分子量命名为P12317。与此同时，VickiLundblad实验室改进了她的遗传筛选方法，并筛选了几个与酵母端粒复制密切相关的基因，命名为EST2、EST3和EST4(也称为CDC13)18。这种改进的筛选方法非常有效，它完全消除了酵母端粒酶全酶的亚基。值得一提的是，尽管这一结果只发表在专业期刊遗传学上，其“影响因子”很低，但其影响却非常深远。从那以后，酵母端粒和端粒酶领域的很大一部分能量都集中在阐述这些基因的功能上。经生化方法纯化的四膜虫P123蛋白和经遗传方法筛选的酵母Est2蛋白经TomCech实验室证实为端粒酶催化亚单位：它们含有逆转录酶结构域，如

16、果该结构域的关键氨基酸发生突变，端粒酶活性将消失19。1997年，比汤切晚，第一个发现致癌基因RAS的罗伯特温伯格也参与了这项工作，他的实验室也报道了酵母和人类的端粒酶催化亚单位20，21。此后，端粒酶的催化亚单位和核糖核酸亚单位通过体外转录和翻译系统共表达，并在体外重建端粒酶活性，这证明这两个核心亚单位的存在是端粒酶活性的必要和完整的条件22。摘要直到端粒酶催化亚单位的发现，染色体末端收缩和保护的秘密才最终被解开。端粒和端粒酶的一系列发现完美地解释了这两个问题：染色体末端的DNA由简单重复的端粒序列组成，而端粒(在本文中，端粒DNA简称为端粒，实际上，端粒精确地定义为由端粒DNA和结合蛋白形成的复合物)保护染色体末端，这使得它不同于染色体常见的断裂末端，并且不被各种酶降解，也不相互融合。端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚单位使用其自身的核糖核酸亚单位作为模板，通过转座重复复制端粒DNA，从而补偿染色体复制过程中的末端收缩，确保染色体完全复制(图3)。这的确是一次完美的发现之旅。然而，在显示其固有的简单性的同时，有机体也将显示其固有的多样性和复杂性。应该指出的是，本文只描述了端粒和端粒