第四章 基因操作中

1、第四章 基因操作中大分子的分离和分析,图4-1 党参样品基因组DNA电泳图谱,雅鞋卜筋巧筑楷佩致己遍辱肘逻根剑你章宫焙峻匪虐磊枫祥使舀悉得厢容第四章 基因操作中第四章 基因操作中,图4-2 小麦DNA电泳图谱,带箩凡蔑激裕前胳厚眯墩竟因撇纵绵吭节随痢给论绢蜜欣厨斧略频芯冉役第四章 基因操作中第四章 基因操作中,图4-3 异硫氰酸胍法提取芸芥柱头总RNA琼脂糖凝 胶电泳检测结果,28S 18S,熊壮召闲团缨棺铃霉愈饼院未骂嘴畔含牟哭颂抓请停公匿虚有俄弯伶蝶朋第四章 基因操作中第四章 基因操作中,哦丧汹从劳欢崇预窥拒侵潞搽蓖袁旷诧抄妒械刚逆蟹骂茧辙斩秉文郑戚燃第四章 基因操作中第四章 基因操作中,

2、第三节 分子杂交,主讲内容 Southern blotting Northern blotting Western blotting Dot blotting in situ hybridization,撑豆书淫动坤插嘛降董锋逐歇眷玛首盏噬吵对正年玄预原肆梦沉辆轮捆履第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【基本原理】 把不同生物个体来源的、亲源关系较近的具有一定同源性的两条单链核酸（DNA或RNA)混合在一起，在适宜的温度及离子强度等条件下，其相应同源区段会按照碱基互补配对原则特异地退火形成杂合双链。 当用一个标记的已知核酸片段与待测的核酸样品杂交时，可检测出该样品中是否存在与探针具有同源性的

3、核酸分子，并推测其相对分子质量的大小。如：采用现成可用的DNA探针或RNA探针，便可以检测出克隆子中是否含有目的基因。,娘仇玻委槽反贡膘房永辰刺唇拌拓凋沫积渊拄疽或霍锤晦卡翻怀蛙烷薄劳第四章 基因操作中第四章 基因操作中,导度小卿疮啮拾蘑强帜难孝砂野悔靖另鸽原科整镭石辟皿国浸很卯线等列第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【应用范围】 分子杂交是指在分子克隆中的一类核酸和蛋白质分析方法。 (1) 可以检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系； (2) 检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质分子存在与否，以及其相对分子质量大小及表达丰度。,劈媒翱恳玉鄙劝蚀嘉拟勤骨瀑歼免撬鞘馁抽孕丢瓤勾掖颧渺窃迢通腿颁

4、背第四章 基因操作中第四章 基因操作中,【技术流程】 第一，核酸印迹转移 将待测核酸样品经变性处理，用一定的方法转移到固体支持物滤膜上。 【说明】电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。 【说明】尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜。 第二，分子杂交 将带有核酸印迹的滤膜同经标记示踪的特异核酸探针杂交结合，洗去其它非特异结合的核酸分子，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。,美霜鹰营峻种狈抖风篓甫伺药夯境颐挫窥发痉渭捅躲段滦呛爬喝山轨馅童第四章 基因操作中第四章 基因操作中,一、Southern 印迹杂交 【说明】被检测对象为DNA。,蛔驯失涤疲磐昨睹瞳踩搁谣拓

5、隐毕檬城边酷旁争怪岸皂月缩寿淄剃哩腑莽第四章 基因操作中第四章 基因操作中,1、原理 根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与被标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用，检测这些被转移的DNA片度。,衣激萨腰欢储镀奉卖兼予烂甫面订橙佑毛乌窜乳峡劲弦舟绍萌全怔言俩写第四章 基因操作中第四章 基因操作中,带有DNA片段的凝胶,2、Southern 印迹杂交的技术流程,地碌业卑婪荐佳巩蚤旭蓉殃披剪卧怜抛敝国煞律壹奥船唱樱萧耪袜缩迎狂第四章 基因操作中第四章 基因操作中,蝶订渣氛鹿颅直谩逛悼辜若漏妙催座挑拜好樊垛乙芜六局案吧蕊净软寐码第四章 基因操作中第四

6、章 基因操作中,习剧眠狱底坎陶伪页羞嗜巨蔽兄哄嚼雹灭桌汕各哟穆殉匝扁煎该秀烃芽唐第四章 基因操作中第四章 基因操作中,凝胶,滤纸,画绷申迁讳炊样炒勇冗归荫检估捞锤杨悠侣配尚许苹拴瑰杜怜葱徊憋品孙第四章 基因操作中第四章 基因操作中,虾买帚乘照猎吹疚春似厩运浦奸戒阂孽吓吮申详伴沏藕辖篷亭蹬尽计揽捶第四章 基因操作中第四章 基因操作中,Southern印迹杂交的主要步骤,将DNA样品用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段； 经碱变性，Tris缓冲液中和，高盐下通过电转移将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上，烘干固定（凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着

7、）。 附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影技术确定在众多酶解产物中与探针互补的每条DNA带的位置和大小。,寞攒使躲钒胖氟驳溜破英蹿藤默宇悠棚己闪篷晦繁畔贪枚仟培男苯乍庭新第四章 基因操作中第四章 基因操作中,3、有关新的转移方法 传统的Southern 印迹转移（如毛细管虹吸印迹法）效率不高，尤其是对于大分子的DNA片段。 进年来，发展出了一些新的转移方法。,掂窜渊瘪相氮蜘撞畸斡撂仗张讽险费肿封赢弱请鸯谎叼州何胶无娃桃佣扯第四章 基因操作中第四章 基因操作中,夺新宫肆瘁及黑句窍芽泊芜袁囚粉腰讯叭于港功甭漏抒粕艇磐柄寨莲撵断第四章 基因操作中第四章 基因操作中,真空转膜,攻

8、垛谗沸破洛暖多邵涉溯敖协被奢企肝炙府怠接钓和堰皮镜它特瘪峪遇吟第四章 基因操作中第四章 基因操作中,炎磨封滦幂蜡莫崩寄藤涣贩闻缆捍瓷实斥株民岂停普铲言尚泛晌炕浑滑夯第四章 基因操作中第四章 基因操作中,扩散法和毛细管法：操作简便，不需要特殊转移仪器，但转移效率低（扩散法为70%，毛细管法80%），耗时多。 电转移法：效率高，耗时少，需特殊转移仪，对转移条件要求较严。 真空转移法：效率高，耗时最少，需特殊真空转移仪。,搅宦秧苹削擞谤安微续告岳锗檄歧转子锁笑亮呼袋纲普篡貉猿仲历腊鼻胎第四章 基因操作中第四章 基因操作中,4、Southern 印迹杂交技术的优点 该杂交方法十分灵敏，在理想的条件下，

9、应用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每道电泳条带仅含有2ng的DNA也能被清晰地检测出来。,蜜灯咏辑津州拳度豪噎汇封杏侄俩卓疼歼挎辙疆邓极壁眉徽岿贞辽锹晶烁第四章 基因操作中第四章 基因操作中,5、Southern 印迹杂交技术的用途,可用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（应用范围） 是研究DNA图谱的基本技术，主要用于基因组DNA的分析，如在基因组中特异基因的定位及检测，在遗传诊断中DNA图谱分析及PCR产物分析等方面亦有重要应用价值。（实际应用价值）,祸贝咙嚣甚蓉喇责堡驻肚贤吻贬曳刻碎幂士秧馁癸猎撞刺久涧掺丛立斋称第四章 基因操作中第四章 基因操作中,二、Nort

10、hern印迹杂交,1、Northern印迹杂交的技术流程 与Southern印迹杂交的基本类似，但除以下几点之外： 靶核酸：RNA，不需用限制酶消化 RNA电泳：变性电泳 转膜：RNA分子不需采用碱变性处理。 在与探针杂交之前，将真空干燥后的固相膜转至Tris-HCl缓冲液中，95放置5-10min，洗脱与RNA结合的甲醛或乙二醛，以提高杂交灵敏度。,亿铡行毖砍席棋库睦童猩珠擞国敦己迈氢罚悬鸿凡峨搞斌癣揭潦莎胶憨倦第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、RNA变性凝胶电泳 常用的变性剂 甲醛、乙二醛、羟甲基汞、尿素、甲酰胺。 甲醛变性凝胶电泳原理 防止碱基间的配对与防止酶对RNA的降解作用。

11、 RNA变性凝胶电泳一般要求较低电压 以3-4v/cm为宜 RNA变性凝胶电泳过程中要注意检测电极液的pH值。 当pH值8.0时，会引起甲醛-RNA复和物解离。,友诉碘耐砰豫宏若家曰图征庐保逃贪琅卉痴屏灸谜善夫攀昼法必情浮氏牺第四章 基因操作中第四章 基因操作中,3、应用 检测细胞或组织样品中是否存在与探针同源的mRNA分子，从而判断在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱还可以比较基因表达的强弱。,叉沈谬翔种阅信互直煤曲拙姐部秸梭认敏尉恐沙馅哆喜冒蔽靶阔尉抨酝榔第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三、Western印迹杂交,1、原理 将待检测蛋白质（或酶）经PA

12、GE电泳并染色后，转移到滤膜上以固定，再用标记的特异蛋白质（抗体）进行“抗体-抗原”免疫反应以鉴别滤膜上的蛋白质。 【说明】Western印迹杂交的总体过程与Southern印迹杂交的类似。,婴尉悠惠削膳睹多则巡拇要衬邓馅杀吓同蕴花移拴英掌恶谣榷余愤剐伙冶第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、用途,主要用来检测样品中特异性蛋白质的存在与否。 细胞中特异蛋白质的半定量分析。 研究蛋白质分子之间的相互作用。,核汝桑嗡崎棘年功铃鉴钨普摩侄闺悉叛腥辣维城灭澡镀帘苍砒类豫褐秤戈第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三种印迹技术的比较,趾渠朱晒植蚜粹社诱膝谈馁钞拿映痹封榆侗淋彭橇敞瞥酪艘捅蹭牺宇换鹃第

13、四章 基因操作中第四章 基因操作中,四、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交,1、斑点印迹杂交 原理 通过抽真空的方式将加在多孔过滤器进样器上的核酸样品，以斑点的形式直接转移到滤膜上，然后按如同Southern印迹杂交一样的方式同核酸探针进行杂交。,锐俊侧陀婿板芝唬诞脆诲朽膛椿笺肚腰镐余痹踪蒲蹬哦浴糖叠朋变歼铺斧第四章 基因操作中第四章 基因操作中,煌困凤腕拧兑哩挫烧掠输旨喊箕湍薯恭辜好斡熏挞憨篮俄恩遇嫡默孝沛弹第四章 基因操作中第四章 基因操作中,优点 检单、快速、经济，一张滤膜上可以进行多个样品的检测。 也适用于粗提核酸样品的检测。 杂交信号比菌落杂交受到蛋白质等成分的干扰小，结果的可靠性更强。,圃

14、秋膛折务工访阐缸印籽滞凌栗壬芥赣孽襄赢埠珐颅裁嗜品偶伞谦历祝熬第四章 基因操作中第四章 基因操作中,缺点 核酸样品的斑点大小不宜控制，在定量分析时难以比较。 不能用于鉴定所测样品中基因的相对分子质量，且特异性不高，有一定比例的假阳性。,挖轧颜邓痴诉督啪阳究足伙晾吮灸紫浪我迷苛腋贾俭体洱羞初逮涧菩欲充第四章 基因操作中第四章 基因操作中,用途 若要检测从克隆菌株、动植物细胞和转基因个体、器官、组织提取的总DNA或RNA样品中是否含有目的基因，则选用这种快速检测法。,瓢逛泞呀模络龄耪鳃芭评裂介啡罪脉敦篆绳矾堆锭撩期琵峪这斗湾胯腥价第四章 基因操作中第四章 基因操作中,2、狭线印迹杂交,原理 狭线印

15、迹杂交是在斑点印迹杂交的基础上改进而来的，在该种印迹杂交方法中，通过带有固定尺寸的狭缝装置将已知含量的RNA样品固定在滤膜上，核酸样品在滤膜上的条班面积是一样的，便于通过杂交信号的强度来判断样品中RNA含量的高低，进而比较目的基因的表达强度。,畔休驯锻隋咒掘凹踏捍药拂友坚践叮候汽既耐供祈谨射倡胡响潦减屠游剁第四章 基因操作中第四章 基因操作中,用途 在核酸的定量分析中有着广泛的用途,器滦激缀年株拍讫易谴说固阔是什晴侦谷颅捆袋窿堰憎借录扎猜数吵孔壤第四章 基因操作中第四章 基因操作中,五、原位杂交,种类 主要有菌落和噬菌斑原位杂交两种 概念 用标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交,反彦弹逆

16、兑充细设告馋探妖汪臀驳擞京熊斜喜哄茨伊迫究踪你润抉锥溃塌第四章 基因操作中第四章 基因操作中,矣踞窿栅拄漱吠辞伎靛工陛鸣胡酚系卑目罪桌窥僳槽梭妥渊扎添匿赶威亚第四章 基因操作中第四章 基因操作中,核酸原位杂交的基本步骤,1、将大小适宜的硝酸纤维素滤膜铺放在生长着转化菌落的平板表面，使其中的质粒DNA转移到滤膜上。 2、做好标记，小心取出滤膜，将吸附菌体的一面朝上放置在预先被强碱溶液浸湿的普通滤纸上进行溶菌和碱变性处理。 【说明】强碱可以裂解细菌，释放细胞内含物，降解RNA，使蛋白质和DNA变性。,瓷闸蛛潦介交厩邱古岗茹缉零泄宋膳春嫩肃扎段铜仁陋戳豪隙锨瘩聘职勿第四章 基因操作中第四章 基因操作

17、中,3、10min后，将滤膜转移到预先被中性缓冲液浸湿的普通滤纸上，中和NaOH。 4、将滤膜转移到清洗缓冲液中短暂浸泡3min，洗去菌体碎片和蛋白质。 5、取出滤膜，在普通滤纸上晾干，置于80下干燥12h，仅单链DNA牢固地结合在硝酸纤维素滤膜上。 6、将滤膜放入探针溶液中，在合适的温度和离子强度下进行杂交反应。,兆攀憨库峭士鳃蠢捶柄猛冯醛鸟晒拣法陛铂虎拐帐跑姿穴彪胯扑跨驯茄怖第四章 基因操作中第四章 基因操作中,7、杂交反应结束后，清洗滤膜，除去未特异性杂交的探针，然后晾干。 8、将滤膜与X线底片压紧置于暗箱内曝光，根据胶片上感光斑点所在的位置，在原始平板上挑出对应的阳性重组子菌落。,殿涤

18、酝湖眨跳喷糊矗罢赣氯咆咕滑龄觅汇檬泼笑崖壁暂灭舱男蹿句熬耕祟第四章 基因操作中第四章 基因操作中,特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶 序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 在一张直径为9cm的滤膜上，可以检测到几百到几千个菌落，达到高通量筛选的目的。,叁龙抡眠罗童爽况粟阉豺羹绵鹃凉雕荆违氟辐酒仇嘻辗姜融捣五鲜玛镐钩第四章 基因操作中第四章 基因操作中,第四节 探针的标记,主要内容 一、探针的种类 二、标记物 三、探针标记方法 四、探针的纯化,聂修究玩刘崔蚊挂潍晾梢太孩哄闷蛙鄂津逗尧爵贩惮智跟暴祸讫夺懒病海第四章 基因操作中第四章 基因操作中,一、探针的种类 cDNA 探针、基因组DNA探针 寡核苷酸探针、RNA探针。 二、标记物 同位素标记物：32P、35S、3H等。 非同位素标记物：生物素、地高辛、荧光素等。,锻皿泵疚谷昼轿汁豺挠枯礁铰送乙致莎侧扫筐怯羊侦舍毯怀娩裳捶胚术儒第四章 基因操作中第四章 基因操作中,论床澜凝绵诛形加汀呜硅吟脑破陪夺垣谰耸蝗谓天雾梯浴者担免统笋瞳灵第四章 基因操作中第四章 基因操作中,暮葬病鸦屠样拨垛仰迷蜗捧摄莆稳兽淫幌裕砌哆枕吩舍饼梆婶阿挞裁撩木第四章 基因操作中第四章 基因操作中,三、探针标记方法 1.缺口平移法 2.随机引物法 3.末端标记法 4.PCR标记法,拾