高效液相色谱详解-郝建涛

1、高速液相色谱法(HPLC )是邓凤霞能源化工重点实验室、片计程仪、基础理论上操作前准备工作Agillent 1100的操作常见故障诊断HPLC在科研中的应用，一、基础理论、 溶于流动相中的各组通过固定相时，由于固定相(stationary phase )和作用(吸附、分配、络离子吸引、阻力、亲和)的大小、强弱不同，在固定相中滞留的时间不同，故从固定相中相继流出。1、柱分离原理、电色谱分析法分类、两相状态分类、2、分离模耦合电色谱、液相色谱仪、尺寸截止电色谱、耦合电色谱正相电色谱：流动相极性固定相极性标准分析，80， 电色谱和峰值参数电色谱(chromatogram)-样本在列和检测器中流动，得

2、到的信号时间曲线也被称为电色谱流出曲线。 基线(base line)-在流动相清洗、柱与流动相平衡后，检测器检测一定时间的流出曲线。 通常必须与时间轴平行。 噪声(noise)-基线信号的波动。 通常，电源接触不良、瞬时过载、检测器不稳定、流动相中含有气泡或柱被污染。 漂移(drift)-基线随时间逐渐变化。 主要是由于电压、温度、流动、产水量等操作条件的不稳定，导致柱内污染物和固定相不断溶出也会产生漂移。 3、HPLC中的基本概念和术语、电色谱峰(peak)-由成分在检测器中流动时反应的连续信号形成的曲线上的凸起部分。 正常电色谱的峰值接近对称形正态分布曲线(高斯曲线)。 峰高度(peak

3、height，h)-从峰的峰到峰的底部的距离。 峰宽(peak width，W)-峰两侧拐点处两条切线与基线两个升交点之间的距离。 半峰宽(peak width at half-height，Wh/2)-峰高的一半的峰宽。 峰面积(peak area，A)-由峰和峰底包围的面积。 死区时间(dead time，t0)-不保留分量的保留时间。 即流动相(溶剂)通过柱的时间。 保留时间(retention time，tR)-从取样开始到列后面的成分的最大浓度出现的时间。 流动相的洗脱方式、等度洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、

4、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱、倾斜洗脱MeOH 梯度洗脱是HPLC的常用手段，梯度洗脱装置的流动相中含有两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中使流动相的组成连续或断续变化，调节其极性，使样品中各成分具有较高的分离度，实现各成分的顺利分离，梯度洗脱提高柱效应，进行分析4、高速液相色谱法的应用范围，高速液相色谱法沸点高，相对分子质量大，适于分析热分解的不稳定有机化合物、生物活性物质及多种天然产物，这些个化合物约占总有机化合物的80%，应用于化工生产、制药工业、食品工业、生化工业、医学临床检验和环境监测等领域、5、HPLC的系统、输液泵持续提供相当于人

5、的心脏、连续、稳定、精确的产水量样品引入系统柱的重要部分，其中样品实现了分离检测器分离样品的数据记录和处理装置，可以实现、输液系统、样品引入系统、分离系统、检测系统、 实现数据处理系统、HPLC的系统构成Agilent 1100高速液相色谱法、液瓶、真空脱气机、混合室、自动试验机、分离柱、VWD， 手动试样、自动试样、六方阀试样、分离体系柱、功能：成分分离、目标：极限分辨率高，吸附剂化学键和固定相柱化学键合相柱：70%将不同的官能化学基通过化学键合和硅凝胶表面的游离水酸化学基，形成化学键合和固定相，形成化学键合和相柱。反相： C18，6.5 %； c8、15%； 反相色谱是目前应用最广泛的高速

6、液相色谱法方法。 正相： 20%； 控制-NH2、-CN等(手性柱、离子交换柱) : 10%、柱室、温度，保证分析结果的重现性，降低流动相的黏性系数，降低柱压，保证电色谱系统的稳定性，对升温用反相HPLC分离强疏水性肽的影响(B27 ) 流动相： A:含有0.05%三氟冰乙酸的水B:含有0.05%三氟冰乙酸的乙腈2% B/min样品量：l(50g的6M尿素/5%冰乙酸) uv:nm流速： 1 mL/min室温液相柱： C18柱尺寸： 4.6 x 250 mm 5m，室温300C 400C 500C 600C 700C，可提高柱温度，提高柱效应(提高灵敏度)，检测系统，药典液相检测器，检测器简介

7、(1)，紫外吸收检测有波长固定、波长可变、光电三极管阵列3种。 特征：选择性检测器，波长检测范围： 190-800nm； 对产水量和温度的易感性低，灵敏度高(10-9g )应用最广泛，可以选择对大多数有机化合物响应的流动相的流速和温度变化不敏感的波长，操作可以用于容易梯度洗脱。 定量基础： Lambert-Beer定律、AKbc、光电三极管阵列检测器、紫外检测器重要进展光电二极管阵列检测器： 1024个二极管阵列、各检测特定波长、计算机高速处理、三次元立体频谱图如图所示。 检测器简介(二)、荧光检测器(fld )原理：某溶质对紫外光激发后放射可见光(荧光)性质的检测。 特点：选择性检测器，灵敏

8、度高(10-12g )，对产水量和温度的易感性低。 对稠环芳烃、维生素b、曲霉、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物化合物等有反应。 检测器简介(三)、检测器简介(四)、蒸发光散射检测器(ELSD )原理：通过检测光散射程度来测定溶质浓度的检测器。 柱后的流出物在通向检测器的途中，在高速载体瓦斯气体(氮瓦斯气体)中成为雾状的液滴，进入蒸发漂移管，流动相蒸发，含有溶质的雾状的液滴成为非易失性的微粒，通过载体瓦斯气体，通过检测器。 在检测器中，光被散射的程度取决于溶质粒子的大小和数量。 特点：消除溶剂干扰作用，不受温度变化影响，灵敏度高，是一种通用型检测器。 检测器介绍(5)、电导检测器(

9、ECD )原理：监测溶液电导变化的检测器。 特点：选择性检测器，测定时要求恒温，对流动相组成变化反应明显，灵敏度低(10-3g )。 适用于络离子性化合物。 差示折光指数检测器(RID )原理：监测参比池和测定池溶液的折光率差来测定试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温度变化为0.001，灵敏度低(10-6g )，二，在提升机操作之前，我们应准备什么？ 如何处理样品？如何选择流动相？如何设定机器参数？ 一个样本的预处理最好使用流动相溶样本。 使用预处理除去试料中的强极性和柱填料和不可逆吸附的杂质。 用0.45m的过滤薄膜过滤除去微粒子杂质。 样品准备，样品过滤头类型： 30mm内径：适合大

10、样品过滤，从0.2m和0.45m两种规格材料中，有电池里肌肉、冰乙酸纤维、聚四拉夫领氟乙烯。 处理样品的体积小于50l。 适用于13mm内径： 0.2m和0.45m两种规格的广泛过滤。 3mm内径：适用于小样品量的过滤，有0.2m和0.45m两种规格。 处理样品的体积为7l。 过滤膜类型：聚四拉夫领氟乙烯过滤膜：适用于所有溶剂、酸和盐，无任何可溶物。 冰乙酸纤维过滤烟嘴：不适用于有机溶剂，特别适用于水性溶液，推荐用于蛋白质及其相关样品。聚己二酰己二胺过滤烟嘴：适用于大部分有机溶剂和水溶液，可用于强酸，不适用于70%乙醇、二氯甲烷、二甲基甲酰胺。 再生纤维素过滤烟嘴：蛋白质吸收低，同样适用水溶性

11、样品和有机溶剂。 注意：1:一张过滤烟嘴只能用一次。 2 :不要把水相和有机相混同起来。 2流相的制备、流动对样品具有一定的溶解能力，保证样品成分不沉淀于柱中(或长期保留于柱中)。 流动相具有一定的惰性，与样品不发生化学反应的流动相的黏性系数尽可能小，分离效果好，延长液体泵的寿命(用提高温度的方法可以降低流动相的黏性系数)，流动相的理化性质必须适应所用检测器。 使用UV检测器时，优选使用紫外吸收低的溶剂进行调制。 流动相的沸点不要太低。 不那样的话容易产生气泡，无法进行实验。 流动相配制后，必须脱气。 请准备移动相。 电色谱级纯乙腈或甲醇水高纯水、18.2Mcm、过滤装置、1、竖塔， 起到保护

12、机器作用的管柱：由于填料粒子细，所以管柱的内腔小，溶剂和样品中的细粒子容易堵塞管柱和毛细管。 仪表：溶剂和样品中的细小粒子在增加样品阀门的堵塞和磨损的同时，也增加泵头内的蓝宝石阿匹斯神活塞杆和活塞的磨损。 2、为了消除污染对分析结果的影响，溶剂准备：在脱气、目的、流动相使用前，必须进行脱气处理，去除溶解气体。 这是为了防止在溶出中流动相从柱流到检测器时压力降低而产生气泡。 气泡会增加基线的噪音，降低灵敏度，无法解析。 溶解氧将样品中的一部分成分氧化，柱中的固定相分解，改变柱的分离性能。 如果使用FLD，荧光可能会突然地消失。 常用的脱气方法，氦原子脱气法：液体中氦原子的溶解度比空气低，连续吹氦

13、原子脱气，效果好，但成本高。 加热回流法：效果好，但操作复杂，有毒性挥发污染。 抽真空脱气法：容易抽有机相。 医学超声脱气法：将流动相装入医学超声容器，用医学超声进行10-15min振荡，该方法效果最差。 上线了真空脱气法： Agilent1100LC真空离线采用膜渗透技术，不需要上线了脱气、智能二烯烃特罗尔，不需多馀的操作，成本低，脱气效果明显优于上述几种方法，适用于多价溶剂系统。 3、根据流动相流速的选择，具体是柱的内径选择，4、波长选择，首先用可见紫外分光光度计测定样品液的吸收谱，选择最佳测定波长，如最敏感的测定波长，避免其他物质的干扰作用。 从紫外光谱可知，HPLC下的响应值也很大，吸

14、收率小于0.5时，HPLC测量的面积会变小。 在5个记录时间、初次测定时，使空白对照溶剂、对照品溶液及供试品溶液分别通过针，收集尽可能长的时间的图像(例如3.0成分以上)，确定样品中的被分析的成分的峰的位置、分离度及杂质的峰是否在长时间内溶出，影响主峰的测定三、检查Agilent 1100的机械操作、1、流动相，Purge阀(清洗阀、排液阀)处于打开状态，Purge阀、逆时针打开清洗阀，顺时针关闭清洗阀，毛细管出口、样品器、废液管、清洗阀打开后，溶剂流入废液瓶在松动的状态下，将流动相装入溶剂瓶中，将过滤头浸入液面下a水、b水、c甲醇、乙腈、d缓冲液中，2、选择洗涤线，再选择流动相1.0的异丙醇

15、9.0水(按此比例配制溶液后装入矿元素瓶)，将流速调节为约1d/3s。3、打开电脑，等待TAP窗口显示，打开4，1100各模块开关，双喀呖声online，直到灯状态，5，1100自检完成，工作站化工自动1100 其他功能菜单、文件处理、运行控制、设备控制、删除顺序、塔斯克、上线了帮助、工作站塔斯克切换快捷方式、方法网站数据库快捷方式、顺序网站数据库快捷方式、运行方法、运行顺序、什么？ 我们知道，要运行样品，需要设定泵流速、流动比率、柱温、检测器波长、样品校准等控制设备的参数，Agilent化工站中， 所有参数(包括设备控制和数据分析以及设备相关运行等)都称为一种方法，所以要运行样品，首先必须得

16、到正确方式，才能在Agilent化工厂获得方法，通常需要调用现有的方法，或者用自各儿编辑新方法我们需要向Agilent化工厂建构一种通过查阅药典、专业技术资料、EPA等资料得到详细样本分析方法的这些个方法，启动仪器得到数据。6、方法编辑、1 )调用方法，在Method中喀呖声Load Method工作站，显示下一个诊断计程仪，在右侧的诊断计程仪中选择调用方法名，喀呖声OK，该方法变为活动状态， 使用Edit Entire Method编辑完整的方法，2 )编辑新方法，选择要编辑的内容，由画面1:方法组成，在所需部分之前进行选择，否则该方法不包含该部分的内容。 例如，本方法中不包含数据分析的内容。 方法信息、设备控制和数据收集、数据分析、运行计划、方法信息、画面2 :方法信息、方法说明，例如方法的用途、来源等信息。产水量(Flow )、流动相组成(Solvents )、停止收集时间(Stop Time )、坡度计程仪表(Timetable )、压力限制设定(Pressure Limits )、泵的操作参数、压力限制： Max最高压力、Min最低压力、流动相坡度表输入停止收集时