抗生素生产工艺8.ppt

1、第三节 发酵培养基的设计,2,发酵工业培养基的要求,1、单位培养基能产生最大量的目的产物； 2、能使目的产物的合成速率最大； 3、副产物合成的量最少； 4、质量稳定、价格低廉、易于长期获得； 5、尽量不影响后处理。,3,本节内容,1.2发酵培养基的 组成要素,1.1培养基的 类型和用途,1.3发酵培养基的 设计及优化,发酵培养基,4,教学重、难点,重点：掌握发酵培养基组成要素及培养基设计和优化。 难点：发酵培养基的设计及优化。,5,一、培养基的类型和用途,6,一、培养基的类型和用途,根据来源分： 根据主要成分或使用目的分： 3. 根据用途分：,营养不能太丰富，尤其是有机氮源； 无机盐浓度要适量

2、，否则会影响孢子量和孢子颜色； 注意pH和湿度。,营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素含量也要高一些。,除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等。,7,生理代谢 菌种筛选,种子培养,发酵培养,8,二、发酵培养基的组成要素 P59,碳源 氮源 无机盐和微量元素 前体及其他生长因子,9,碳源功能： 为微生物菌种的生长繁殖提供能源和合成菌体所必需的碳成分； 为合成目的产物提供所需的碳成分。,(一) 碳 源 p60,10,在微生物发酵过程中，普遍以碳水化合物作为碳源,微生物对不同糖类利用率：单糖双糖 戊糖多糖,微生物对碳源的要求主要用于菌体生长、能源消耗及产物合成,

3、葡萄糖最容易利用，但过多会加快呼吸，导致溶氧不足、pH下降，抑制生长与产物合成,11,功能： 构成菌体细胞物质（氨基酸、嘌呤、嘧啶、蛋白质、DNA和RNA）和含氮代谢物。,(二) 氮 源p61,12,氮源种类,有机氮源,无机氮源,玉米浆、鱼粉、酵母粉、蛋白胨、黄豆饼粉、花生饼粉、棉籽饼粉等； 特点：菌体生长旺盛、菌丝浓度增长迅速。,铵盐（硫酸铵和氯化铵）、硝酸盐（硝酸钾和硝酸钠） 、硝酸铵等；可引起pH变化。,13,功能： 生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物（调节细胞酶活性），保持培养液中电解质浓度和渗透压。,(三) 无机盐及微量元素 p61,14,磷酸盐 硫酸镁 钾盐 微量元素,磷是菌

4、体细胞核酸、核蛋白的组成成分，也是许多辅酶和高能磷酸键的必须组分。磷酸盐在培养基中还具有缓冲作用。 工业上常用K3PO43H2O、K3PO4和Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O等磷酸盐，也可用磷酸。, 除了组成某些细胞的叶绿素成分外，并不参与任何细胞物质的合成； 处于离子状态时，是许多重要的酶（己糖磷酸化酶，柠檬酸脱氢酶、羧化酶等）的激活剂； 不但影响基质的氧化，还影响蛋白质的合成。, 钾离子与细胞渗透压和透性有关； 是许多酶的激活剂； 促进糖代谢。, Zn、Co、Mn、Cu等元素大部分作为酶的辅基和激活剂； 一般作为碳、氮源的农副产品天然原料中，本身就含有某些微量元素，不必另加

5、； 特例：VB12的生产，由于钴是其组成成分，Co的需要量随产物的增加而增加，因此在培养基中需加入氯化钴以补充钴。,15,（四）前体及其他因子p62,1）前体： 指在抗生素生物合成中，菌体利用它以构成抗生素分子中的一部分而其自身结构又没有显著改变的物质，但是产物的产量却因其加入而有较大的提高。,16,前体发现：,最早是从青霉素的生产中被发现的。 加入玉米浆后，青霉素单位可从20U/ml增加到100U/ml； 玉米浆中含有苯乙酸，它能被优先合成到青霉素分子中，从而提高青霉素G的产量。,17,抗生素发酵过程中所用的一些前体物质,18,2）其他生长因子,生长因子：广义说，指凡是微生物生长不可缺少的微

6、量有机物质都称为生长因子(又称生长素)，包括氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等； 狭义说，生长因子仅指维生素。 不是所有微生物都必需的，只是对于某些自己不能合成这些成分的微生物才是必不可少的营养物质。,19,3）产物合成促进剂,促进剂：细胞生长非必需，但加入后却能提高产量的添加剂，称为促进剂。,20,常用促进剂,表面活性剂洗净剂（脂肪酰胺磺酸钠）、吐温80（聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯 ）、植酸等 二乙胺四乙酸（EDTA） 大豆油抽提物 黄血盐（三水亚铁氰化钾 ，K4Fe(CN)6.3H2O ） 甲醇,促进剂能促进产量增加的原因： 主要是改进了细胞的渗透性，增强了氧的传递速度，改善了菌体对氧的有效利用。

7、,A.在酶制剂发酵过程中，加入某些诱导物、表面活性剂及其他一些产酶促进剂，可以大大增加菌体的产酶量。,21,22,B.抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。,23,B.抗生素工业在发酵过程中加入某些促进剂或抑制剂，常可促进抗生素的生物合成。,实例： 巴比妥能够增加链霉素产生菌的抗自溶能力，达到推迟菌体自溶的目的。 聚乙烯醇可以改变发酵液的物理条件，达到改善通气效果、增加细胞渗透性的目的。,24,发酵基础培养基成分选择的原则 发酵培养基的优化 培养基设计时应注意的问题,三、发酵培养基的设计及优化p63,25,发酵基础培养基确定方法,1、做好调查研究工作； 2、对

8、生产菌种要了解； 3、根据生产和科学研究的需要选择培养基； 4、根据经济效益选择培养基原料。,26,发酵基础培养基成分选择的原则,（1）C 源 葡萄糖：分解代谢物会组遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性； 诱导酶制剂生产：易利用的碳源（葡萄糖、果糖）不利于产酶；难利用碳源（淀粉、糊精）对产酶有利。,27,（2）N 源 微生物利用N源的能力随菌种、菌龄而已。多数能分泌胞外蛋白酶的菌株在有机氮源上可良好生长。 同一微生物处于不同生长阶段对氮源的利用能力不同。生长早期易利用铵盐、氨基氮；生长中期利用蛋白质的能力强。,28,(3)合适的C、N比 （1）N源：过多，菌体生长旺盛，pH偏高， 不

9、利于代谢物积累， 过少，菌体繁殖量少，影响产量。 （2）C源：过多，易造成较低的pH， 过少，易引起菌体的衰老和自溶。 一般工业发酵培养基的C/N0.2%2.0%,29,(4)合适的pH 利用营养物质后，酸碱物质积累或代谢酸碱物质的形成会造成培养体系pH变化，配制培养基时要予以充分考虑。,30,发酵培养基的优化,培养基成分的含量最终都是通过实验获得的,合理的实验方法,多因子实验： 正交实验设计法 均匀实验设计法 析因设计法,31,1.1 正交试验设计的基本概念 正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通

10、过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。,1 正交试验设计的概念及原理,32,举 例：,要考察增稠剂用量、pH值和杀菌温度对豆奶稳定性的影响。每个因素设置3个水平进行试验 。 全面试验：可以分析各因素的效应 ，交互作用，也可选出最优水平组合。但全面试验包含的水平组合数较多，工作量大 ，在有些情况下无法完成 。,33,正交试验设计的基本特点：,用部分试验来代替全面试验，通过对部分试验结果的分析，了解全面试验的情况。 它不可能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析。 虽然正交试验设计有上述不足，但它能通过部分试验找到最优水平组合 ，因而很受实际工作者青睐。,34,1.

11、2 正交试验设计的基本原理,正交设计就是从选优区全面试验点（水平组合）中挑选出有代表性的部分试验点（水平组合）来进行试验。,35,1.3 正交表及其基本性质,1.3.1等水平正交表的记号及含义,36,eg:,表示,？,表示各因素的水平数为2， 做8次试验，最多考虑7个 因素（含交互作用）的正交表。,试验次数(行数)因素*(每列水平数-1)+1,37,38,（1）任一列中，各水平都出现，且出现的次数相等 例：L8(27)中不同数字只有1和2，它们各出现4次；L9(34)中不同数字有1、2和3，它们各出现3次 。 （2）任两列之间各种不同水平的所有可能组合都出现，且对出现的次数相等 例：L8(27

12、)中(1, 1), (1, 2), (2, 1), (2, 2)各出现两次；L9(34) 中 (1, 1), (1, 2), (1, 3), (2, 1), (2, 2), (2, 3), (3, 1), (3, 2), (3, 3)各出现1次。,1.3.3正交表的性质正交性,39,（1）任一列的各水平出现的次数相等 （2）任两列间所有水平组合出现次数相等，使得任一因素各水平的试验条件相同。 这就保证了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干扰。从而可以综合比较该因素不同水平对试验指标的影响情况。,1.3.3正交表的性质综合可比性,40,1.3.4 正交表的特点,A. 正交表中任

13、意一列中，不同的数字出现的次数相等；,表示：在试验安排中，所挑选出来的水平组合是均匀分布的（每个因素的各水平出现的次数相同） 均衡分散性,41,B. 正交表中任意两列，把同行的两个数字看成有序数 对时，所有可能的数对出现的次数相同。,表示：任意两因素的各种水平的搭配在所选试验中出现的次数相等 整齐可比性,以上是设计正交试验表的基本准则,42,对于多因素试验，正交试验设计是简单常用的一种试验设计方法，其设计基本程序如图所示。正交试验设计的基本程序包括试验方案设计及试验结果分析两部分。,2 正交试验设计的基本程序,43,试验目的与要求,试验指标,选因素、定水平,因素、水平确定,选择合适正交表,表头

14、设计,列试验方案,试验方案设计：,试验结果分析,44,进行试验，记录试验结果,试验结果极差分析,计算K值,计算k值,计算极差R,优水平,因素主次顺序,优组合,结 论,试验结果分析：,试验结果方差分析,列方差分析表，进行F 检验,计算各列偏差平方和、自由度,分析检验结果，写出结论,45,例：确定赖氨酸产生菌FB31发酵培养基成分乙酸钠、氯化胺、酵母膏、无机盐适宜浓度对发酵培养基的影响。 明确目的，确定指标。本例的目的是通过试验，寻找一个最佳的发酵培养基。 选因素、定水平。,46, 选择正交表。此试验为4因素3水平试验，不考虑交互作用，4因素共占4列，选L9（34）最合适，可以作为试验误差以衡量试

15、验的可靠性。 表头设计。4因素任意放置。 编制试验方案。试验方案见如下：,47,整个设计过程一句话归纳为： “因素顺序上列、水平对号入座、实验横着做”,48,试验结果分析,分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素； 判断因素对试验指标影响的显著程度； 找出试验因素的优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好； 分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向； 了解各因素之间的交互作用情况； 估计试验误差的大小。,极差分析 方差分析,49,Kjm，kjm,计算简便，直观

16、，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。以上例为实例来说明极差分析过程。,3 正交试验的结果分析,3.1 直观分析法极差分析法,极差分析法R法,1. 计算,2. 判断,Rj,因素主次,优水平,优组合,Kjm为第j列因素m水平所对应的试验指标和，kjm为Kjm平均值。由kjm大小可以判断第j列因素优水平和优组合。,Rj为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。Rj越大，说明该因素对试验指标的影响越大。根据Rj大小，可以判断因素的主次顺序。,50,正交实验结果,51,（1）计算Ki值。Ki为同一水平之和。 以第一列A乙酸钠因素为例： K1=21.0+42.0+31.0=94.0 K2=38.0+22.0+33.0=93.0 K3=24.0+36.0+30.0=90.0,试验结果极差分析,52,（2）计算各因素同一水平的平均值ki。 k1=33.0，k2=31.0，k3=30.0 （3）计算各因素的极差R，R表示该因素在其取值范围内试验指标变化的幅度。 R=max（ki）-min（ki） （4）根据极差大小，判断因素的主次影响