红豆杉内生菌的分离.ppt

1、红豆杉内生真菌的分离及拮抗作用研究，学名：班级：讲师：博士论文答辩，1。研究背景2。方法步骤3。测试结果4。实验分析，1。研究背景：红豆杉属第四纪冰川遗迹物种，其自然分布范围狭窄且分散。此外，人为盗窃和野蛮的种子采集使天然红豆杉的生存濒临灭绝。研究表明，红豆杉还含有多种生物活性物质，具有明显的抗菌和细胞毒作用。目前红豆杉的培养通常采用细胞培养和植物愈伤组织诱导的新方法，但细胞生长速度慢，容易污染杂菌，提取和获得生物活性物质的成本高，生产设备要求高，目前不可能进行大规模工业化生产。微生物技术具有周期短、易于控制和扩增的优点，微生物基因工程技术已经相对成熟。内生真菌是指一类生活在植物体内或其生活史

2、的特定阶段的真菌，内生真菌一般存在于植物体内。研究表明，内生真菌次生代谢产物的合成和转化或次生代谢产物的独立合成种类丰富、数量大，可能具有生物合成特定植物活性成分的能力，已成为新型医药(农业)药物活性物质的潜在资源。本实验的目的和意义红豆杉内生真菌的研究已成为国内外学者研究的新热点。通过对红豆杉内生菌的分离和拮抗研究，可以发现新的菌株，这些内生菌通常会产生具有新结构和生物活性的次生代谢产物。特别是在自然资源日益稀缺和环境污染问题日益严重的今天，利用内生菌进行药物生产、环境保护和生物防治的优势显而易见。本实验通过红豆杉内生菌的分离和对常见病原菌的拮抗作用的研究，筛选产生抗菌活性物质的新菌株。2.

3、方法和步骤：1 .内生真菌的分离、表面消毒、无菌水研磨、接种于PDA培养基上，用40ugmL链霉素，28静置培养37天，两组对照、2。内生菌的纯化，菌丝生长后，将菌丝顶端转移到含有40ugmL链霉素的新鲜PDA培养基中，用三点法获得纯培养物，放入28培养箱中培养37天。3。内生真菌拮抗活性的测定、细菌悬液的制备、内生真菌发酵液的制备、抑菌效果的研究，取200微升指示菌液涂于培养基上，置于4个冰箱中2030分钟。外径为1cm的打孔器在板的中心打孔，孔的底部在酒精灯的火焰上加热以密封底部。移液管吸取130微升内生真菌发酵液，并将其放入孔中数天。用直尺测量抑菌圈的直径，记录抑菌圈的大小。4。内生真菌

4、菌落观察。实验结果：(1)红豆杉不同组织中内生真菌的分离结果红豆杉不同组织中内生真菌的种类和数量存在一定差异。总的来说，红豆杉茎中内生真菌的数量最多，叶中内生真菌的数量最少(见下表)。对内生真菌进行了编号。根内生真菌编码为G1G5，茎内生真菌编码为J1J9，叶内生真菌编码为Y1Y4。红豆杉不同部位内生真菌的数量、图8茎段内生真菌的分离纯化结果，(2)内生真菌对病原菌的拮抗作用采用打孔法研究内生真菌发酵液的抑菌活性，培养28天后观察抑菌圈。结果表明，只有分离自茎段的真菌J8发酵液对石榴干腐病和大肠杆菌有拮抗作用，而其他内生真菌对指示菌没有明显的抑菌活性。结果如下：红豆杉内生真菌J8对病原菌的拮抗

5、作用，图10 J8对石榴干腐病的抑制作用，图11 J8对大肠杆菌的抑菌效果，(J8 J8在PDA培养3天后，形成黑色菌落，背面为浅棕色，呈椭圆形菌落，表面短而蓬松，散在黑色颗粒状孢子，如下所示：(1)从红豆杉植物中共分离出18株内生真菌。不同组织部位内生真菌的种类和数量不同，茎中内生真菌较多，叶中内生真菌较少，这与现有文献报道一致。然而，郑法新等人从70年生的根中分离到22株内生真菌，而在本实验中仅从10年生的根中分离到5株。据推测，这可能是由于根的不同生长期造成的。实验材料限于枣庄大学生物园10年生红豆杉植物。内生菌的分离结果及其抗菌活性与文献报道略有不同，这可能是由于生长期不仅影响红豆杉材

6、料中内生菌的数量和种类，而且具有不同的合成活性物质的能力，需要进一步探索和研究。(2)对18株内生真菌的发酵液进行抑菌试验。从茎中获得的J8菌株对石榴干腐病菌和大肠杆菌具有抑菌作用，在防治石榴干腐病方面具有一定的开发潜力。由于实验条件的限制，所选试验菌株的种类和数量有限，因此只初步确定了内生真菌的抑菌作用，需要扩大试验菌株的范围，为实际应用奠定基础。(3)用于内生真菌分离的表面消毒比一般的组织培养更严格，但这种消毒方法也容易杀死植物中的微生物，因此分离的内生真菌的种类和数量可能比植物中所含的少。因此，在内生真菌分离过程中，掌握合适的材料消毒时间对最终分离的内生真菌的数量和种类至关重要。因此，有必要通过进一步的实验来研究消毒时间对内生真菌分离的影响。其次，在分离内生真菌的过程中，所使用的培养基都是基础培养基，因此不可能保证红豆杉组织中的所有微生物都能被分离，一些稀有微生物也不能在人工培养基上生长。(4)共生真菌难以鉴定。虽然内生真菌已被分离，但由于个人经验和实验时间有限，仅初步观察到从茎中分离的拮抗J8形态，需要进一步鉴定。内生真菌的