RT-PCR.ppt

1、实验四 RT-PCR及琼脂糖凝胶电 泳原理与技术,实验目的,了解RT-PCR的基本原理。 熟悉RT-PCR的常规步骤。 掌握琼脂糖凝胶电泳技术。,实验要求,掌握PCR技术。 学会操作PCR仪。 熟悉琼脂糖凝胶电泳技术。,实验原理,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去

2、几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。,实验原理,PCR是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，其特异性是由两个人工合成的引物序列决定的。在DNA聚合酶催化的一系列合成反应中，用两段寡核苷酸作为反应的引物。一般情况下，这两段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分别与模板DNA两条链上的各一段序列互补；而这两段模板序列又分别位于待扩增DNA区段的两侧。反应时，首先是在摩尔数过量的两段寡核苷酸及4种dNTP存在下，将模板进行加热变性。随之将反应混合物冷却至某一温度，使引物与它的靶序列进行配对，称为退火。然后，退火引物可在DNA聚合酶作

3、用下进行延伸。上述过程是由温度控制的。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环。,实验原理,PCR是在合适条件下的这种循环的不断重复。PCR按照底物（即模板DNA）的来源和引物的特点可分为经典PCR、逆转录PCR（RT-PCR）和免疫PCR（IM-PCR）。其中，RT-PCR较常用。在这个反应体系中，被检物为RNA，如mRNA，需借助逆转录酶的逆转录作用，转变为相应的互补链DNA（cDNA）才能进行PCR。为此，逆转录和PCR分两步进行，先作逆转录获得cDNA，再以此为模板作PCR。,注意事项,PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 引物：

4、引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。（引物设计原则见下张幻灯） 酶及其浓度：催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 dNTP的质量与浓度：分装后-20冰冻保存，多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200mol/L，注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。,设计引物应遵循以下原则：,引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200

5、-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,注意事项,

6、模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。要防止RNase降解RNA。 Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR反应条件的选择：温度、时间和循环次数。 温度：在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4

7、0 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。,注意事项,变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。 退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。 Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。,注意事项,延伸温度与时间：PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段

8、，延伸时间1min是足够的。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。 循环次数：循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,实验器材及试剂,1.实验器材：PCR仪、水平电泳槽、灌胶架，梳子、电泳仪、扫描仪、微波炉、移液枪（ 20l-200l、0.2-2l、2-20l）、吸头（200l、10l）、吸头台、200l PCR管、试管架、纸巾、废液缸等。 2.试剂：PCR试剂盒、GeneFinder、Marker（100bp）、琼脂糖、无水乙醇、冰醋酸、Tris

9、碱等。,实验步骤,RNA的提取： 组织100mg（细胞1107） 加1mlTRIzol（细胞用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块） 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管） 颠倒混匀10下，室温5分钟 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5）变性作用 颠倒混匀10下，室温5分钟 4，离心12000g，15分钟 转上层水相（约400l）于另一1.5mlEP管中,RNA的提取, 加等体积异丙醇（约400l），混匀室温10分钟 4，离心12000g，10分钟 弃上清 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml 4离心7500g，5分钟 弃上清，空

10、气干燥5-10分钟（不能完全干燥） 溶于DEPC水中至20l（10l-20l） （可在55-60水中，10分钟助溶）,注意事项,处理RNA样品时必需仔细小心,其程度取决于样品的用途和来源.由于RNA酶存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏,因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要.对于制备mRNA来说这些预防措施尤其重要. 方案: 1）工作区域应与进行普通微生物实验的区域分离开,特别是那些用于细菌接种,培养基和试剂配制的区域,那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.2）如有可能,使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头

11、,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶。,注意事项,3)双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活. 4)用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有RNA酶.5)分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理. 从组织中提取RNA则要注意:动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶,故在

12、所有步骤中均应戴橡胶手套并经常更换.,注意事项,记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾,它们来自吸液操作或来自我们自己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染。 一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶.因此从这些细胞中制备RNA应采取更严格的预防措施. 分离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA(18s和28s) 条带模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解.,注意事项,1、RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则用DEPC溶解 2、细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60放置至少一个月（甚至可一年以上） 3、

13、RNA在75%乙醇中，2-8至少可保存一周，-20至少可保存一年,第一步：RT反应,逆转录反应体系（总体积10l） MgCL2 2l 10RT buffer 1l RNase free H2O 3.75l dNTP 1l RNase Inhibitor 0.25l AMV Reverse Transpase 0.5l Random 9 mers 0.5l RNA样品 1l 反应条件：30 10min，42 30min， 99 5min， 5 5min。,第二步：PCR反应,PCR反应体系（总体50l） 5PCR buffer 4l ddH2O 7.9l Taq酶 0.1l Primer F 2

14、l Primer R 2l cDNA 4l 反应条件：94 2min, 94 30s, 50 30s, 72 2min. 35cycles(),第三步：电泳,将5l PCR产物，加入点在parafilm上的预染buffer中（产物：buffer5：1），反复吸打混匀后进行电泳，一般电流为10mA，电源100-150V，电泳30分钟，紫外灯下观察，满意的结果扫描打印。 注：凝胶浓度的选择取决于DNA分子的大小。分离小于0.5kb的DNA片段所需胶浓度是1.2-1.5%,分离大于10kb的DNA分子所需胶浓度为0.3-0.7%, DNA片段大小间于两者之间则所需胶浓度为0.8-1.0%。,琼脂糖凝

15、胶电泳步骤,1.移取适量的琼脂糖(如制备1.5%的琼脂糖胶液，就移0.45g的琼脂糖溶于30ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。然后将2lgenefinder加到胶中，再将琼脂糖在微波炉加热至完全融化，然后冷却至50。 2.缓慢地将琼脂糖胶液注入一个带有“梳子”的胶床中(避免气泡产生)，若有气泡产生用塑料移液管移去。现在许多种胶床都可方便买到并且根据其说明书而得以应用。 3.根据胶的大小让胶凝固20-60min.,琼脂糖凝胶电泳步骤,4.当胶正凝固时，准备DNA样品并取适量的DNA（如5l）加1l加样缓冲液(genefinder:6loading buffer=1:9)混合

16、，加样液中包含染料如溴酚蓝（BPB）。 5.胶凝之后，轻轻移去梳子。将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑末端），注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。 6.加DNA样品及进行电泳：使吸管与加样孔垂直，使吸管尖端刚好在加样孔开口之下，缓慢将DNA样品加入加样孔中。,琼脂糖凝胶电泳步骤,7.加样完毕后，正确连接电泳槽和电源（黑的连阴极，红的连阳极）在打开电源之前，设定好电压和时间（电压100mV, 时间30min.） 8.通过检查加样孔附近的铂线来检测接线柱是否连接良好。若连接良好，负极附近的铂丝会有气泡产生。 9.电泳过程要进行一个合适的霎时间。电泳时间的选择取决于胶的长度和电

17、压的大小。胶越长，电压越低，所需时间越长。然而，使用高电压时，大的DNA片段的分辨率很低。 10.凝胶摄影,注意事项,1.TAE和TBE都是常用的缓冲液，TBE相对于TAE而言有较高的缓冲量。 2.电泳中，溴酚蓝和0.5Kb大小的DNA一起移动，这可给泳动最快的DNA片段提供一个指征。 3.DNA的迁移依赖如下因素： DNA分子越小，迁移越快。琼脂糖其浓度越低，迁移越快。DNA的构象，环状切口DNA比线状DNA迁移快。两电极间每厘米的电压，电压越高，迁移越快。,注意事项,4.引物：1个OD260值相当于33g,2个OD260值相当于66g 引物的贮存液浓度为100mol.L-1 ；工作液浓度为20mol.L-1。故2个OD260值的引物稀释为100mol.L-1的工作液时所需的加水量：（66g/分子量）104所需加水的l数.一般PCR反应中的引物终浓度为0.21.0mol.L-1. Xmol.L-1=OD260/A(16000)