微量中和实验-齐立.ppt

1、流感细小病毒微量中和实验技术、国家流感中心、CNIC、临床标本采集急性期和恢复期血清快速诊断细小病毒分离RT-PCR HAI或微量中和实验试剂盒(MDCK或EGG )排列了CPE HA HAI (WHO FLU H5 KIT )， 直接抗原检测疫病的爆发、微量中和实验的优越性，一方面，传统的流感细小病毒中和实验主要基于MDCK细胞球的病变抑制作用进行观察，且耗时费力。 结合感染细胞球快速鉴定方法，改进的中和实验可在2天内完成，可一次检测大量血清样本2，微量中和试验技术已成功检测出血清中的流感细小病毒a5型抗体，可推广血清中其他禽流感细小病毒亚型中和抗体的检测水平，其易感性为凝血抑制试验三、人群

2、中禽流感细小病毒缺乏特异性抗体，因此检测部分血清可反映人群的免疫状态。 但是，诊断可疑患者时，急性期和恢复期血清中的中和抗体滴度需要云同步测定，可以确定恢复期的血清抗体水平高于急性期(4倍)。 实验原理，1个抗原抗体间的中和反应，1:20diuttony :1:40diuttony，1:160diuttony，HA抗原，血清中的中和抗体， 2ELISA的实验原理、MDCK细胞球中的细小病毒核蛋白质(NP )抗原、NP-AG、小鼠抗流感细小病毒a型核蛋白质单克隆抗体、NP-AB、细小病毒核蛋白质抗原-核蛋白单克隆抗体复合体、 辣根过氧化酶标识牌的羊抗小鼠IGG，磷酸苯二胺， 实验材料一、中和反应

3、的实验材料(一)细小病毒1 )使用甲5型细小病毒时，9-10日龄的SPF胚良好，一般用3.7培养26-28时间得到高滴度，一般的血液凝固滴度在128以上不能用于中和实验，二)冻结保存的细小病毒不能再使用，三)进行中和实验进行细小病毒滴定(TCID50 )的滴定，便有必要对细小病毒进行定量；2 )血清样本1 )接受的待测血清多次分装，冷冻保存到-20中，一般就不需要重复3次以上的冷冻溶解。 2 )血清样本中含有待检测血清、阳性及阴性对照血清，人血清实验前需要5.6失活3.0分、动物血清需要RDE处理分注，除非有特异性抑制因素，否则均排除在外。 (1)MDCK细胞球和细胞球培养试剂1)MDCK细胞

4、球(犬肾上皮细胞球)初期的细胞球(1.0代)和对数生长期的细胞球对细小病毒感染有最大敏感性(细胞培养皿中70%-90%)细胞培养液DMEM牛血清抗生素3 )用于细胞消化的胰酶和VERSON、ELISA实验材料， 1抗体1小鼠抗流感细小病毒a型核蛋白质单克隆抗体2 .抗体2:辣根过氧化酶标识牌羊抗小鼠IGG 3.清扫液：PBS 0.05%TWEEN-20 4 .封闭液：PBS 1%牛血清白蛋白0.05%TWEEN-20 5 .基质和基质溶液： 所用基质为磷脂酰二胺(OPD )基质溶液终止PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液6 .反应液，质量控制、细小病毒中和实验技术是相当复杂的过程，中和反应有关的因素

5、为细小病毒、抗血清和宿主细胞球，这些个的因素变化影响中和试验的结果。 因此，必须严格对中和试验的全过程进行质量控制，每次测定均需滴定阳性阴性的血清对照、阳性阴性的细胞球对照、细小病毒用量。 血清对照血清对照包括人和动物的血清阳性和阴性对照。 即血清中是否含有测定细小病毒专一性的中和抗体(阳性对照) (阴性对照)。 血清对照一般分为多种组分，2.0保存，避免反复冻融。 1阴性血清对照(1)动物血清一般来源于未免疫或未感染动物，即与待检查血清同种动物的正常血清。 (2)人血清一般来自于与被检查血清年龄相同的正常人群，他们不暴露在被检查细小病毒之下。(3)测定中阴性对照血清和被检血清应处于相同稀释水

6、平。 2阳性血清对照(1)动物血清一般来源于免疫后或感染后的动物。 (2)人血清一般以急性期和恢复期两种血清为对照。 *人血清在使用前经加热灭活处理，动物血清经霍乱滤液RDE (即接纳体破坏酶催化剂)处理，排除非特异性反应因子。 二细小病毒与细胞球的对照应在每次试验中设定阳性与阴性细胞球的对照，对加入细小病毒的工作液进行滴定检查，便能得到正确可靠的实验结果。、血清阴性对照、血清阳性对照、1、2、3、4、5、6、7、8、9、1.0、1.1、1.2、质量管理、实验步骤，该实验被分为3个步骤： (1)细小病毒滴定(2)细小病毒中和试验(3)酶催化剂免疫吸附实验(ELISA )。 细小病毒滴度测定(组

7、织培养的半数感染量TCID50滴定) (1)流行性感冒细小病毒的制备鸡胚尿囊腔接种法制备流行性感冒细小病毒，尿囊液的收获，血液凝固试验测定细小病毒的存在，分注后-70冷冻保存。 (二)细小病毒稀释采用一瓶冷冻保存的细小病毒尿液，在1100稀释(100毫升的细小病毒液9.9毫升的稀释液)的第一列加入146毫升的1100稀释细小病毒液，进行系列的半对数稀释，制作10-2、10-2.5、10-3、1.0 -。 每孔含有100毫升的细小病毒液，每稀释度重复4次。 (MDCK细胞球的准备用1细小病毒稀释液将细胞球稀释成1.5X105细胞球/ml。 2加100毫升细胞球(1.5X104细胞球/孔)装入经稀

8、释的细小病毒微量培养板。 在375%CO2温箱中培养18-22时间。 一、二、三、四、四、五、六、五、六、六、六、六、六、七、八、八、八、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、九、八、八、九、八、， 废弃46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul、46ul，使用-TPCK- trypsin、TPCK- trypsin、没有细小病毒的稀释液、a、1、 细小病毒tcid 5.0滴定方法，(1)测定一半组织细胞感染量(tcid 5.0 )，丢弃1微量培养板的细胞液，用250毫升P

9、BS洗涤细胞球。 抛弃PBS (不使细胞球干燥)，加入100毫升/霍尔固定液。 3霸复盖微量培养板，室温下固定细胞球1.0分钟。 扔掉4个固定液，使微量培养板在室温下干燥。 使用用5ELISA检测细胞球感染的6ELISA检测仪，在490nm波长下，测量每孔的吸光率(OD )值，并对细胞球阴性对照的平均OD值进行计数。 如果不同稀释度的细小病毒孔平均OD值含有细胞球阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为细小病毒生长阳性。 用8里德和Muench的方法计算了细小病毒滴度，最终获得了TCID50/100微升。 在进行9中和试验之前，稀释了细小病毒液，使5.0毫升含有100TCID50流感细小病毒。

10、 另外，TCID50值的计算一般采用读-曼(reed-muench )法来计算。分别计算稀释(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)阳性阴性阳性数阴性率%阳性数104011011/11100104.507/7105313/475105.50405 /按5.1细小病毒稀释度计算的阳性数(1)和阴性数(2) 2，计算阳性和阴性孔的累计数：阳性孔累计数为以下从阴性孔累积数从上向下累积的(4) 3计算出的阳性孔的比例：比例(5)=(3)/(3) (4)、(6)=(5)从x 1004计算出的距离比例距离比例=(比-50%大的阳性率- 5.0 )/(比-50%大的阳性率-比-50%小的阳性率)=(7

11、5-50 ) 阳性率超过TCID50对数50%的最高稀释对数距离比率x稀释系数的对数=5.3x 0.5=5.15 tcid 5.0=1.0-5.15/100微升100TCID50/100微升=10-3.15 100TCID50/50微升2=1.0-3.15 0.3=1.0-2.8=13360631、b、c、d、e、g、h、的、的、3、3、4、4、5、4、5、5、5、6、5、6、6、6、6、7、8、8、8、8、8、8、8、8、8、9、 细胞球对照，细小病毒对照，点滴，血清，a，SYD，SA，DK/SING，X-49，n，1，2，3，4，5，6，7，8，9，1.0，1.1，1.2，流感细小病毒的微

12、量中和实验设计，9.0，50，50，50，90，90 5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50 5.0、5.0、5.0 5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、50、100、100、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、b、c DK/SING，X-49，n，1，2，3，4，5，6，7，8，9，1.0，1.1，1.2，流感细小病毒的微量中和实验的抽样方法：50ul，50ul，

13、50ul，50ul，50ul，50ul，50ul 5.0，100，100，100，100，100，100，100，100，100，5.0，5.0，5.0，5.0，5.0，5.0，5.0，50，50，50，50，50，50，50，50，50 5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、100、100、50、50、100、100、100 f、g、h、细胞球对照、细小病毒对照、点滴、血清，A1-A10，SYD，SA，DK/SING，X-49，n，1，2，3，4，5，6，7，8，9，1.0，从

14、1.1、1.2，a1，5.0，5.0，50 5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50 5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、5.0、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、50、100、50、100、50 e，f，g，h，细胞球对照，细小病毒对照，点滴，血清，a，SYD，SA，DK/SING，X-49，n 1，2，3，4，5，6，7，8，9，1.

15、0，1.1，1.2，稀释2倍的情况a-1-a-1.1，1:0 133601600，133603200，133606400，1336012800，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100 100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100，100 100，100，100，100，100，100，100，100，5.0，100，5.0，100，100，100，100，100，100，100，5.0 100，100 100，100，100，100，100，b，c，d，e，f，g，h，细胞球对照，细小病毒对照，点滴，血清，a，SYD，SA，DK/SING，X-49，n，1，2，3，4，5，6，78，9，9 、50UL(1