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文档简介

1、。1,流式细胞术应用概述,流式细胞术系列讲座概述,2,流式细胞术在临床试验和科学研究、免疫学试验和科学研究、肿瘤学试验和科学研究、细胞凋亡分析、血液学试验和科学研究中的一般介绍,其他应用,主要内容,3,流式细胞术概述,第一部分,4、什么是流式细胞术?流式细胞仪(:)是一种集光电子物理、光电测量技术、液体流动技术和计算机技术于一体的细胞测量和分析仪器。流式细胞术(FCM):是一种使用流式细胞术来测量、定量分析和分类快速流动液体中的细胞或生物颗粒的技术。5,流式细胞术的特点,多参数测量和分析(散射光和荧光);快速测量和分析可达每秒1000-10000个细胞,分选纯度可达99%以上。获得的数据分析结

2、果更具统计学意义;通常,被测物体,如各种细胞,必须在一个细胞悬浮液中。此外,它还可以测量生物粒子,如微生物,或合成微球的非生物粒子。6,FACSCIBUR,特点:光路调节系统固定自动化程度高,操作简单,使用寿命长,配有1-2个激光细胞,分选速度慢,主要用于细胞分析,临床(桌面)。7、可通过流式细胞术检测的细胞参数、细胞结构、细胞大小、细胞粒度、细胞表面积、核质比、DNA含量和细胞周期RNA含量、细胞功能、细胞表面蛋白抗原、细胞内蛋白抗原、细胞内细胞因子、细胞增殖、细胞内钙离子浓度。8、流式细胞仪分析数据常用图:(二维)点图,适用于:双参数分析,9、流式细胞仪分析数据的常用图:直方图,适用于:单

3、参数分析只需观察一定荧光强度的变化,10,流式细胞仪分析图,SSC(横向散射光)-反应细胞中有多少颗粒,FSC(正向散射光)-反应细胞大小,散射光信号,11,特征信息荧光信号,FL1(第一荧光)-FITC(异硫氰酸荧光素)FL2(第二荧光)-PE(藻红蛋白)FL3(第三荧光)-PerCP,PeCy5和其他PL4(第四荧光)-APC(藻红蛋白),流式细胞分析,双色直接染色,设置门:选择要分析的细胞群,设置阴性和阳性范围,13,流式细胞术在临床检测和科学研究中的应用,第二部分,第一部分,免疫学检测和科学研究应用,14,1,细胞表面分子标记(以淋巴细胞亚群检测为例)。15,原理,人淋巴细胞可以根据其

4、生物学功能和细胞表面抗原表达的T淋巴细胞特异性标志物是CD3,包括CD4和CD8T细胞。淋巴细胞的特异性标记是CD19。自然杀伤细胞表达CD56或CD16,但不表达CD3。通过将各种单克隆抗体与淋巴细胞表面抗原结合,并与多色荧光染料相匹配,淋巴细胞可被分为不同的亚型。然后求出每个子群的比例。16、T淋巴细胞、淋巴细胞亚群检测:T细胞、T细胞亚群、自然杀伤细胞、B细胞、17,淋巴细胞亚群和功能,18,CD4 CD25 CD127-Treg检测,19,淋巴细胞亚群和功能,20、淋巴细胞亚群与疾病、21,淋巴细胞亚群检测的意义,疾病机制的研究,疾病的辅助诊断,移植后的免疫检测,治疗方案的确定和疗效的

5、评价,CD25比正常值高5-10%,表明排斥反应的CD4/CD8比值下降即将发生或已经发生,表明当并发危险感染0.2时,免疫抑制剂CD2 HLA-DR必须停止并增加5-10%。如果CD25没有增加,则表明巨细胞病毒感染、慢性疲劳、感染后综合征、纤维肌痛、类风湿性关节炎、过敏等。预防疾病。22,淋巴细胞亚群检测的意义,活动性和非活动性系统性红斑狼疮的鉴别,23,2,细胞内分子流式细胞术检测(以Th1/Th2细胞因子检测为例)。25、Th1/Th2细胞,Th1细胞因子介导的细胞免疫反应引起的迟发性过敏反应,巨噬细胞活化,局部炎症刺激来源:病毒,某些细菌Th2介导的体液免疫反应引起的B细胞增殖,分泌

6、多克隆免疫球蛋白,促进I型过敏反应(过敏反应)。26,Th1/Th2细胞,PBMC离子霉素刺激4-6小时,流式细胞仪检测细胞内细胞因子,细胞内细胞因子白细胞介素-4和干扰素-,28、Th1/Th2失衡相关疾病、由细胞内寄生性病原体引起的感染性疾病、针对Th2细胞保护的Th1细胞及其细胞因子以及它们的细胞因子。如肺结核、慢性过敏性疾病、Th2细胞及其细胞因子、过敏性哮喘等。(IgE)。Th1细胞及其细胞因子通常是炎症增强的标志。Th2细胞及其细胞因子对肿瘤相关免疫Th2细胞及其细胞因子免疫/抑制。29、Th1/Th2细胞检测的意义、疾病治疗、发病机制研究、用Th1和Th2相关细胞因子IFN-治疗

7、麻风病、用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗白介素-4抗体治疗真菌和寄生虫感染、用Th2/Th2细胞因子平衡药物:治疗巨细胞动脉炎、疾病治疗监测、二、流式细胞术在肿瘤学中的应用,肿瘤的发生和发展,31,1,DNA倍体和细胞周期分析,32,细胞周期和DNA倍性分析的原理,1。正常细胞的脱氧核糖核酸含量稳定在2C水平。有性细胞的DNA含量为1C,3。从增殖到分裂的细胞数量从2C增加到4C,4。凋亡细胞的脱氧核糖核酸断裂,含量为2C。细胞用荧光染料染色,用流式细胞仪测定细胞的脱氧核糖核酸含量。可获得细胞周期三个阶段(G0/G1、S和G2/M)的DNA含量,反映细胞的增殖状态和非二倍体(非整倍体

8、)的DNA含量。Diploid: 100.00 %倾角G1: 54.38 %倾角g 2: 46.90 15.91%倾角S : 29.71% G2/g 1: 1.95% CV: 5.23,G0/G1,S,G2/M,34,二倍体: 64.50 %倾角G1: 92.45 %倾角49.24 G2: 2.30%倾角98.48S : 5.26% G2/G 1: 2.00% CV: 3.21非整倍体1: 35.50% An1 G1: 97.69% An1 G2333 58.5335、可检测标本、新鲜血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺等。冷冻或固定(酒精或甲醛)保存的组织通常固定/嵌入样本(蜡块)用

9、于组织检查。通常最好的结果来自新鲜或冷冻的标本。嵌在蜡块中的标本需要特殊处理。36,意味着70%的人类癌症具有非整倍体或细胞周期变化,1。罗斯杰斯。病理学中的DNA倍性和细胞周期分析。纽约:伊加库肖因;1996:47-60,DNA倍体和S期比率-指导2卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、子宫内膜癌和原发部位未知的癌症的治疗-早期(I/II期)DNA倍体和DNA指数-长期预后和无病生存2卵巢癌-晚期,2。流式细胞术推荐医疗保险国家覆盖政策。hcfa网站,1999年。37,2,肿瘤相关基因编码蛋白的检测,38,P53,乳腺癌,这与乳腺癌的病理分级和淋巴结转移显著相关。结直肠肿瘤,结直肠癌和胃癌的早期发现,均与

10、预后有关,肝细胞癌与组织分级、肿瘤预后、转移和肿瘤大小等密切相关。39、Bcl-2、Bcl-2在正常组织中的表达、造血系统的淋巴细胞、单核细胞和其他腺上皮、受激素或生长因子调节的前列腺上皮、干细胞如子宫内膜或增殖细胞皮肤的基底细胞、小肠上皮寿命长的分裂细胞神经元胚胎组织、肿瘤组织中的Bcl-2表达、肾肿瘤、肾盂乳头状瘤、肾母细胞瘤、肾嗜酸细胞瘤、前列腺癌、B细胞淋巴瘤、乳腺癌(43%)、甲状腺癌、40、nm23、nm23与各种转移和预后相关41,CD44 (CD44S/CD44V)。42,3,细胞周期蛋白(Cyclin)检测,43,在肿瘤组织、乳腺癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、卵巢癌、前列腺癌等中

11、的表达。化疗前高表达、化疗后高表达、肾细胞癌、结肠癌和肝癌。非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、急性髓细胞白血病等。对化疗不敏感,对化疗敏感,对化疗不敏感,4,检测肿瘤多药耐药(MDR),44,4,检测细胞凋亡,详见下一部分,45,3,流式细胞仪分析细胞凋亡,46,细胞凋亡与疾病的关系。凋亡不足:肿瘤、自身免疫性疾病、过度凋亡:心肌缺血、心力衰竭、神经退行性疾病、病毒感染不足和过度共存:动脉粥样硬化、凋亡和疾病。47,凋亡过程中,在凋亡诱导因子的作用下,线粒体膜电位发生变化,caspase家族被激活,磷脂酰丝氨酸翻转,DNA断裂形成凋亡小体,48,细胞凋亡的检测方法,1。形态检测光学显微镜荧光显微镜

12、(Hoechst 33342,Hoechst 33258,DAPI)电子显微镜2。磷脂酰丝氨酸的外翻分析。线粒体膜电位能的检测。脱氧核糖核酸断裂检测。TUNEL法。caspase-3活性检测(FCM) 7。检测凋亡相关分子(FCM) : Bax、Bcl-Xs、Bak、Bad、Bid等抗凋亡分子: Bcl-2、Bcl-XL和bcr/abl激酶等。8.相关信号通路分子的检测(可使用流式细胞仪)。49,1。磷脂酰丝氨酸外翻分析(膜联蛋白V标记法)原理在细胞凋亡的早期,磷脂酰丝氨酸(PS膜联蛋白V)能以高亲和力和特异性与PS结合。碘化丙啶可以区分活细胞和死细胞。50,结果分析,51,结果分析-优秀,5

13、2,结果分析-差,53,如何得到好的结果,细胞状态更好;细胞治疗的温度问题:药物浓度和时间需要探索;染色后,细胞不能固定,应尽快检测。线粒体膜电位能的检测原理线粒体跨膜电位的降低是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。一旦线粒体膜电位崩溃,细胞凋亡是不可逆的。随着线粒体跨膜电位的存在,一些亲脂性阳离子荧光染料可以与线粒体基质结合,荧光的增加或减少表明线粒体内膜电负性的增加或降低。常用的染料有罗丹明123,3,3-二己基阿卡波亚宁碘化物二(3),四氢-四乙基苯并二氮唑碳菁碘化物JC-1,四甲基罗丹明甲酯(tmrm)等。嘿。55,结果分析,56,3.DNA片段化检测,通过PI染色,分析亚二倍体峰(

14、凋亡峰),方法同“DNA倍性分析和细胞周期分析”。57,4.TUNEl法,也可用于TUNEl检测流程,其检测原理与经典TUNEl原理基本一致。TdT可用于将荧光素标记的dUTP标记到断裂的DNA末端,从而使凋亡细胞具有荧光。流量检测后,可以准确计算细胞凋亡的百分比。经典TUNEl不能这么做。经典TUNEL法的原理。58,结果分析,59,结果分析,结合细胞DNA含量分析,更好,60,5。Caspase家族在介导细胞凋亡中起着非常重要的作用,其中caspase-3是关键的执行分子。Caspase-3通常以酶原(32KD)的形式存在于细胞质中,并在细胞凋亡的早期被激活。活化的半胱天冬酶-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,切割相应的细胞质核底物并最终导致细胞凋亡。用荧光标记的抗活化胱天蛋白酶-3抗体进行细胞内染色,可通过流式细胞仪分析其在细胞凋亡后期和死亡细胞中的活性,胱天蛋白酶-3活性明显降低。61,4。流式细胞术在血液学中的应用,62,1。流式细胞术对白血病的免疫分型,63。白血病细胞的起源、分化和生物学行为不同,急性白血病的分类基本上有三个阶段:FAB分类(1976)(形态学,M),MIC分类(1986)(形态学,M)(免疫学,I)(细胞遗传学,C),WHO分类(2001,2001) (MICM)

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