实验九：鸡胚成纤维细胞的制备

1、实验9鸡胚胎成纤维细胞的制备，第一，实验目的，学习和掌握鸡胚胎成纤维细胞的制备和培养方法；了解原代细胞培养的原理和方法。二、测试仪器、试剂、仪器、超级清洁台、蛋灯检查、灭菌细胞培养瓶、眼科剪刀、眼科镊子、碟子、吸管、离心管等；9-11天龄的鸡胚；哈克斯液，0.25%胰蛋白酶消化液，双抗(10000IU/ml链霉素)，7.5%NaHCO3溶液，DMEM营养液，酒精棉75%。第三，实验原理，病毒可以在易感组织或单层细胞内增殖，产生细胞病变，因此细胞培养是病毒学研究的重要手段，这对于疫苗生产和病毒疾病诊断是必不可少的。原代细胞培养是体外准备细胞培养物的必要过程，从空腔中去除组织，将其分散到单个细胞中

2、，从培养液到初级培养，从初级培养到初级传代培养进行初级培养。作为原代细胞的鸡胚成纤维细胞通过细胞培养实践，了解和认识原代细胞的制备方法及影响细胞培养的主要因素，掌握原代细胞培养方法。4，实验阶段，(a)工作前准备1，预热培养液：将已准备好的生长液、汉克斯液、胰蛋白酶溶液放入37浴缸进行预热；2、用75%的酒精棉擦拭的超净工作台；3、正确布置要使用的设备：确保工作空间充足，操作方便，同时减少污染；4.点燃酒精灯。(2)鸡胚胎成纤维细胞的制造1，鸡胚胎的处理(1)对蛋壳消毒，提取9-11天的鸡胚胎，利用卵检等，选择血管明显活动正常的鸡胚胎，放入卵框，将气室末端向上，酒棉75%对蛋壳气室部位进行消毒

3、。(2)胚胎用镊子打碎蛋壳气室部位，去除该部位。用灭菌眼钳拆开蛋壳基室膜，小心地取下绒毛膜和羊膜，将小鸡胚胎转移到灭菌盘。用剪刀剪去胚胎头、四肢和内脏，用海克斯液冲洗体表血，转移到灭菌小烧瓶上。(3)胚胎均质菌用灭菌剪刀将胚胎粉碎成1mm3小块。加入哈克斯液(组织碎片泛滥即可)，摇晃，静置1-2分钟左右，组织下沉，吸上层悬浮液。为了去除红细胞，重复2-3次。进入杀菌的小三角瓶，吸出海克斯液，直到上等额不变。2，分散细胞(1)通过胰蛋白酶消化预热后的0.25%胰蛋白酶去除，在三角瓶中添加约8毫升。拧紧瓶盖，37消化30分钟，每30毫升轻轻摇晃一次。鸡胚胎细胞由于胰蛋白酶的作用，有利于细胞间的氨基

4、及羧基。把液体搅拌得稍微稠一点，轻轻摇晃的话，组织块就会浮在液体里，不易下沉，这时可以停止消化。如果继续消化，就会破坏细胞膜，不容易粘在墙上，如果消化不够，细胞就很难分散。(2)分散的细胞将消化后的细胞悬浮从浴缸锅里取出，丢弃上层液体，使用5毫升含血清的DMEM生长液(DMEM营养液5%小牛血清100IU/ml清蛋白，ph 7.5%NaHCO3溶液调节pH7.2)，用吸管反复吹气，分散细胞，此时生停止1分钟后下沉未分离的组织块。(3)过滤用4层脱脂纱布吹进的细胞，用扁平的碟子过滤，收集草料。(。(c)化妆和培养1，细胞计数，根据计数结果添加DMEM生长液，调节细胞浓度50万-60万/ml。(本

5、实验中省略此步骤，将2mLDMEM生长液(如果是50mL的培养瓶，则为4mL生长液)，将过滤后的细胞悬浮液0.25mL小心地吸入培养瓶(如果是50mL的培养瓶，则包括0.5mL的细胞悬浮液)，并均匀复盖瓶盖。放在组、日期、37温度框中培养(4小时后细胞粘在墙上，24-36h长成单层，此时可以更换培养液并接种病毒)。化妆后2-4h渡边杏通过大幅度移动培养瓶，使其不影响细胞壁或生长。这个实验培养三天，培养期间每天可以观察一次。三天后拿出来，把培养瓶洗干净，放回实验室。(4)在细胞形态观察检查时，注意培养液的颜色变化，变黄，但不混浊，表示细胞生长，红色表示细胞不生长或生长不好。培养37 24-48h后，通过倒置显微镜观察，细胞长成单层，透明，纤维明显，细胞膜清晰。5，注意事项1，全过程严格的无菌操作2，培养液不要太多，确保细胞的氧气需求3，培养CO2培养箱时不要把盖子拧紧，将CO2