高效液相色谱法原理及其应用

1、高速液相色谱法(HPLC )、作者周媛、第一节高速液相色谱法基本原理、色谱分析法分析法是化学中广泛应用的重要分支，是具有较强生活力的分离分析技术。 一种电色谱方法，使用高压输液泵，将规定的流动相泵放入装有填充剂的柱中，分离测定样品。 注入的供试品从流动相送入列内，各成分在列内分离，依次进入检测器，通过积分仪和数据处理系统记录电色谱信号进行处理，最终得到各成分的电色谱峰值。 (1)高速液相色谱法的特点，一、与经典液质联用比较的现代液质联用是基于经典色谱分析法理论，采用高压泵、化学键合固定相快速分离柱、高灵敏度专用检测器等新实验技术建立的液质联用分析法。 二、与气体色谱法比较1分析对象差异GC :

2、适用于可气化、热安定性好、沸点低的样品，但高沸点、挥发性差、热安定性差、络离子性及高分子化合物样品， 特别是在很多生化样品中，无法检测出占有机物的HPLC :可溶解制成溶液的样品(包括有机介质溶液)不限于样品的挥发性和热安定性，分子量大、不易气化、热安定性差的生化样品、高分子化合物和络离子性样品在广泛用途中占有机物，两种流动相不同HPLC :流动相为液体，流动相与成分之间具有亲和的力，可以提高柱的选择性，改善分离度，对分离起到积极作用。 另外，流动相的种类多，选择馀地宽，改变流动相的极性和pH值也起到控制分离的作用，选择不同比例的2种或2种以上的液体作为流动相也可以增大分离选择性。 3操作条件

3、的差异GC :加温操作(对气体色谱法的分离效率影响最大的因素) HPLC :室温； 高压，三，高速液相色谱法特点，一分离性能高，二选择性高，三检测灵敏度高，四分析速度快，(二)高速液相色谱法分类和分离机理，固定相不同凝聚态：液质联用，液体固体色谱分析法分离机理：分配色谱，吸附色谱法， 按离子交换色谱、空间截止色谱分析法及亲和色谱法流动相与固定相极性的相对强弱不同：正相色谱分析法、反相色谱、一、液固吸附色谱法(LSC )流动相为液体， 固定相为固体吸附剂分离机理：利用溶质分子在固定相表面吸附活性中心能力中所占的差异调节溶剂极性，控制成分保留时间的柱序：强极性成分后柱，弱极性成分前柱，二、液分配色

4、谱(LLC )分离机理：利用成分在两相中溶解度的差异， 适于将相极性的流动相极性小的成分先固定柱，将极性大的成分后固定柱，分离溶解于有机溶剂的极性和中极性的分子型物质，用于含有不同官能化学基物质的分离。 反相色谱固定相的极性大的成分先发柱，极性小的成分后发柱，从无极性分离中极性的分子型化合物。通常，亲水固定液具有疏水性流动相、三、离子交换色谱(IEC )、分离机理：成分与固定相表面络离子交换能力的差异(与流动相的性质无关) 利用离子交换色谱和紫外可见检测器结合解离性化合物离子交换色谱与电导检测器制备无机络离子吉卜赛人格拉夫(IC )，四，空间排斥色谱分析法(SEC ) 适用于检测的分离机理：利

5、用组分的分子大小与凝胶固定相孔径之间渗透系数的差异，根据流动相的性质而不同：流动相为有机溶剂凝胶渗透色谱分析法流动相，水溶液凝胶过滤色谱分析法主要用于生物大分子组分的分离，五、亲和色谱法(AC ) 分离机理：利用组分与固定相表面上配体特异性亲和作用的差异，使固定相具有生物活性的配体与载体表面结合，形成适用于生物样品的酶催化剂、抗体、接纳体等分离六、化学键色谱分析法(BPC )， 分离机理：在吸附分配通过化学反应将固定液官能化学基结合于载体表面的成分的过程中，分离应用较宽的色谱分析法：反相结合色谱分析法固定相：极性小的烷基结合相C8柱、C18柱(ODS柱) 流动相：按极性大的甲醇-水或乙腈-水流

6、动相极性固定相极性、分离过程物理化学原理分类的各种液质联用的比较，(4) 高速液相色谱法定性量化分析方法与气体色谱法分析方法基本相同的定性分析方法：电色谱检验法化学检验法两种光谱联用检验法量化分析方法：外标法内标法面积归一化法(要求各成分出现峰值)、第二节高速液相色谱法法、 可过滤颗粒物质) 2高压泵(输液泵、步进溶出度) 3试样采集装置4柱分离5量测仪器分析6废液出口或成分采集器7记录装置、(1)输液系统1、储存装置：过滤烟嘴2、脱气装置：脱气机移动相脱气： (1)吹气氦原子脱气法(2)加热回流法(3)真空脱气法(4)医学超声脱气法上线了真空脱气法、流动相(洗衣粉、洗脱剂)是影响液质联用分离

7、的非常重要的实验因素。 改变流动相的性质和组成改变溶质成分的保持值、分离选择性和柱效应。 在实际工作中，流动相的选择范围广是液质联用的显着特征。 在液质联用中，成分的保持值的大小依赖于成分和流动相与固定相分子之间的力，如吸附、分配、络离子交换、亲和力等。 (二)高压输液泵和梯度洗脱装置，一、高压输液泵种类高压输液泵，一般分为恒流泵：可输出一定体积流量的流动相2种。 (1)注射式泵(也称为螺杆注射泵) (2)往复式泵(也称为往复柱塞泵)、往复柱塞泵、柱塞向前方移动，流出液体，向柱塞中流动的后方移动，将罐内的液体吸入汽缸。 这种往复运动保证了柱的零配件以稳定的速度流动。 二、高压输液泵的原理，二定

8、压泵：定压泵又称气压放大泵，是输出一定压力的泵。 不要使用不锈钢中有腐食性的溶剂。 例如硝酸、硫酸、盐酸、卤代物、四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃混合物等。 过滤采用过滤烟嘴过滤和垂直漏斗过滤，脱气采用医学超声和过滤的方法。 注意：在使用流动相前，必须清洗，使用含有酸、碱、缓冲液的流动相后，用不含盐的有机溶剂-水清洗，二、高压输液泵的基本要求： 1、产水量范围宽2、重现性和精度好3、脉冲对输出流动相没有影响4、输出压力高耐压高5 .密封性能好6 .具有压力检测和保护功能3 .高压输液泵的性能残奥仪表分析型输液泵的产水量相对标准偏差0.075%0.3%的产水量范围是0.01010ml/min流动相流速

9、13ml/min的最高工作压力3.4.4741.3.6 MPa (300500 BPA )以相同的分析周期，使流动相的浓度比率发生一定程度的变化，使洗脱剂的组成发生梯度性的变化。 因此，在复杂样本中具有较大性质差异的分量可以利用相应适当的电容因子k实现良好分离目的。 梯度洗脱的原理：流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂的组成比率，改变流动相的极性，使各流出成分具有适当的容量因子k，可以在最短时间内最佳地分离样品中的全部成分。 梯度溶出的优点：1.缩短分析周期2 .提高分离能力3 .改善峰型，减少拖尾4 .提高灵敏度。 但是，有时会引起基线漂移。 (三)样品装置，一、手动注入样

10、品器二、六方阀样品装置三、自动样品器、样品阀的基本要求：1.高压耐受力2 .样品量准确3 .样品重现性好4 .无产水量和压力波动影响的样品阀保护措施：1.泵2 .以缓冲液为流动相时，要定期用水清洗样品阀，特别是在库特格拉夫关闭之前。 自动样品的构成部分：1.样品阀2 .样品环管3 .样品针4 .样品瓶5 .心脏支架，(4)柱，柱是液质联用系统分离的核心部分，样品中的各成分由柱分离。 柱的要求：柱效应高：通过减少填充剂的粒度提高柱效应的选择性：通过改变固定相的种类和流动相的种类可以改变柱的选择性。 分析速度快，一、柱材料和规格1柱材料：柱由柱管和固定相组成，柱管用不锈钢制。 HPLC柱的填料材料

11、有硅凝胶、以硅凝胶为沉积基质的结合相、氧化铝和有机聚合物珠等。 2柱规格：粒度通常为3m、5m、7m、10m，柱长1030cm，内径2.6 mm，在4.6mm的内径中最常用。 目前，反相耦合相柱的应用最多，特别是C18，C8柱，二，柱的性能评价1 .理论塔板数2 .非对称因子3 .保持值的重现性三、柱的维护和维护1 .流路过滤器和保护柱2 .避免高压冲击3 .采用适合柱的分离条件： PH 柱温和流动相4 .流动相和样品5 .用强溶剂定期清洗柱，1 .柱的维护柱的使用和保存：所有柱使用缓冲液后， 柱的柱体积必须用柱体积的20-30倍的水洗涤150.6 mm 2.5 ml 50m l 200.6

12、mm 3.3 ml 6.5 ml 250.6 mm 4.2 ml 8.0 ml，(1)反相柱用的保存：将缓冲液或含氯溶液作为流动相使用，每天实验结束后，柱体积的2.0 用乙腈水溶液(5% )洗涤，使柱内的盐完全溶出，再用高浓度的甲醇/乙腈水溶液(80% )洗涤，冲洗柱中强吸附物质。 (2)反相柱的长期保存：将反相柱放入甲醇和乙腈中，将正相柱放入经脱水处理的正己烷，离子交换柱放入5%甲醇水的溶液中，注意不要拧干柱两端的塞子，在室温下保存。 3 .管柱的维护，(1)如果管柱的压实变大，则管柱的出、入口端相反，可以用1020倍的管柱体积的流动相冲洗。 (2)峰值变形不良时，表明柱入口柱床有塌陷的可能

13、性，配合相同类型的填料和乙醇，将塌陷部位填平、压迫。 2 .柱的再生、(1)反相柱的再生工序：甲醇二氯甲烷正己烷-二氯甲烷甲醇(2)正相柱的再生工序：苯正己烷-二氯甲烷-正己烷不存在、(3)离子交换柱的再生工序：用稀酸缓冲液洗涤时，正离子交换柱再生(5)检测器、一、定义检测器是将电色谱洗脱剂中的分量转换成电信号的传感器，用数据处理系统记录，根据得到的电色谱的峰值位置、形状和大小进行定性量化分析。二、分类通用型：差示折射检测器(DRID )、安培检测器(AD )、蒸发光散射检测器(ELSD )专用型：紫外检测器(UVD )、可变紫外可见光检测器(DAD )、荧光检测器(FD )、三、检测器的性能

14、指标(1)、噪声(2)、基线漂移(3)、灵敏度(4)、线性范围(5) 紫外检测器1固定波长紫外吸收检测器2可变波长紫外吸收检测器3光电三极管的阵列检测器只能检测到有紫外吸收的物质，工作原理基于Lambert-Beer定律。 五、波长可变紫外检测器是当前配置最多的检测器，可以根据成分的最大吸收波长设定检测波长。 使用HPLC级试剂和流动相清洁的仪器、流动相和样品，必要时过滤以保证溶剂的相容性，必要时清洗整个系统，去除盐，防止污染，在规定的pH范围内选择使用、维护和记录流动相仪器， 建立高速液相色谱法分析方法的一般过程通常需要基于所分析样本的特性来选择适合于样本分析的高速液相色谱法分析方法，以便在

15、建立经过分析的样本之后建立高速液相色谱法分析方法。 选择适用的柱，决定柱的规格(柱内径和柱长)和选择的固定相(粒径和孔径)。 选择适当或最佳的分离操作条件，确定流动相的组成、流速和溶出方式。 从得到的色谱图中进行了定性分析和量化分析。 第三节高速液相色谱法的应用实例，盐酸左氧氟沙星滴眼液(5ml:15mg ) 的含量测定方法：取电色谱条件和系统适用性试验用十八烷基硅烷结合硅凝胶为填充剂的乙酸铵高氯酸钠溶液(取乙酸铵4.0g和高氯酸钠7.0g，加水1300ml溶解，以磷酸调整PH为2.2的乙腈(85:15 )为流动相； 检测波长为294nm。 取左氧氟沙星对照品、希普欣对照品和杂质e对照品各适量

16、，加入盐酸溶液0.1mol/L溶解，稀释成含左氧氟沙星0.12mg、希普欣和杂质e约6g的混合溶液，液相色谱仪中加入10l记录电色谱，左氧氟沙星峰值保持时间约为1.5分。 左氧氟沙星峰、杂质e峰、左氧氟沙星峰和希普欣峰的分离度分别大于2.0和2.5。 供试品溶液的制备和测定精密计量取本产品1.0ml，放入25ml的烧瓶中，将0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，均匀摇匀制成供试品溶液。 另外，精确称呼适量的左氧氟沙星对照品，加入0.1mol/L盐酸溶液，溶解于每1ml含有约0.12mg左氧氟沙星的溶液中进行定量稀释，作为对照品溶液。 分别采集供试溶液和对照溶液10ul，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法计算峰面积供试样品中C18H20FN3O4的含量。 本品所含盐酸左氧氟沙星以左氧氟沙星(C18H20FN3O4)计，占显示量的92.08.0%。 (1)制备系统适用性溶液，从图谱中得到相应峰之间的分离度。 左氧氟沙星峰的保持时间左氧氟沙星峰和杂质e峰的分离度左氧氟沙星峰和希普欣峰的分离度，(2)调制供试品溶液进行采样，从图像中得到主成分色谱图的