南开大学实用核磁技术 lecture 7---NOESY

1、Nuclear Overhauser Offect (NOE),Nuclear Overhauser Offect (NOE),Albert W. Overhauser,顺反构型 立体构型 芳香环的指定,当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极 偶极作用相互影响。,NOE反应原子核自旋之间通过空间的偶极偶极相互作用; 如果两个1H核间的距离小于5，那么在NMR谱中就可以观察到NOE信号 (在蛋白质中也可观察到小于或等于6的NOE信号 ) I1/dij6 I 两个1H核间的NOE信号强度 dij 两个1H核间的空间距离,Nuclear Overhauser Offect (NOE),Nuclear

2、 Overhauser Offect (NOE),当两个核AX在空间上很接近时，可以通过偶极偶极作用相互影响。选择A的频率照射，会影响X的能级分布，从而改变其信号强度。,Nuclear Overhauser Offect (NOE),W2,W0,单量子数驰豫W1不产生NOE效应。 双量子数驰豫W2和零量子数驰豫W0 产生NOE效应。,小分子运动速度快，采取W2方式： 能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加。 正向NOE效应 大分子运动速度慢，采取W0方式： 能级上的分布数量增加，给以足够的时间，能级上的分布数量也会增加。 反向NOE效应,Nuclear Overhaus

3、er Offect (NOE),当两个核在空间上很接近时，可以通过偶极偶极作用相互影响。NOE有正负,小分子一般有正向的NOE,大分子有反向的NOE.,Nuclear Overhauser Offect (NOE),影响NOE大小的因素： 核共振频率v0 分子在溶剂中的移动性能tc 核间的空间距离，r6,Me cis = +19%,Me trans = -2%,Ha = +45%,1D NOE,优点：时间短，结果直接 可定量 缺点：需要分别激发，无法一次得到全部结果 需要对NOE有估计,1D NOE,1D NOE,13-15a, 12, 14 15a-15b, 14, 16,2D NOESY,

4、2D NOESY,2D NOESY,2D NOESY,2D NOESY,8 - 7, 127 - 18, 183 - 5, 105 - 11, 16, 189 - 10, 17, 1710 - 1611 - 18, 16, 14, 1818 - 13, 1816 - 14, 1713 - 14, 17, 1713 - 17, 1717 - 17,2D NOESY,2D NOESY,2D NOESY,TOCSY (solid lines) and NOESY (dotted lines),AVANCE 900,2.0 mM Lysozyme NOESY,NOE实验对环境变化非常敏感，为了得到高质

5、量的谱图，有如下建议 1）高质量的样品。样品的分子量最好小于800或者大于2000。不然NOE信号会很小。在这种条件下，最好做ROE实验。 2）样品稳定性好。 3）高质量的核磁管 4）最好预先超声或者通氩气除氧 5）NOE实验过程中最好做到恒温。,Nuclear Overhauser Offect (NOE),Rotating Frame Overhauser Effect Spectroscopy （ROSEY）,ROESY可以理解为旋转坐标系中的NOE,由于实验室坐标系中的交叉弛豫速率在小分子为正，在大分子为负，在中间大小的分子(分子量10003000)，如小肽接近零，因此中间大小的分子N

6、OE交叉峰非常弱乃至消失,这时可以用ROESY得到距离信息.但是ROESY实验受频偏等因素影响大，而且有一部分反映了耦合关系,难以定量，解析时需要小心。,ROSEY,与NOESY的区别： 1）分子量在 1000-3000范围，建议使用 ROESY；小于1000和大于3000的化合物宜做NOESY。 2）NOESY 是相敏图, 在对角峰附近的分辨率较差； 3）ROESY 得到的都是吸收谱， 因此有相信号点 (交叉峰) 距离对角峰近的可以考虑使用 ROESY。,ROSEY,ROSEY,Time Dependence of NOE - Mixing Times,NOE dynamically bui

7、lds up and then decays due to relaxation during the mixing time,1) small molecules 0.5 -1 sec. Start with 0.5 sec. 2) medium size molecules 0.1 -0.5 sec. Start with 0.25 sec. 3) large molecules 0.05 - 0.2 sec. Start with 0.1 sec.,同一分子中不同的NOE关系,其混合时间略有不同.如果要得到完美的NOE谱,需要采用不同的混合时间做一系列谱.一般情况下选择0.3 -0.5

8、sec.,关于NOE的几点注意,1、为测定NOE，需要对样品的核磁谱图有准确的指认。最常用的是同核NOE，故需要指认好氢谱。 2、NOE的测定有一维谱和二维谱两大类。一维谱是作NOE的差谱。二维谱的方式即测NOESY或ROESY。 3、NOE的具体数值除和研究的分子密切相关外，也和仪器（工作频率）、实验条件等有关，因而准确性和相互可比性不够好。 4、NOE信息的价值与两个相关的磁性核跨越的化学键的数目有关。当两核越是跨越了多根化学键还显示NOE时，这越能排除相对多的构型、构象可能性，因而较重要的立体化学信息。 5、在应用NOE时，常有某些预定的分子模型，根据NOE的结果可以从中作出明确的抉择。

9、,关于NOE的几点注意,6、NOE最适合刚性分子。在这种情况下，核组之间具有确定的距离。 7、若样品为柔性分子，相对于核磁共振的时标，分子在溶液中存在较快的构象互变，NOE测定的是一个平均结果，因而无法得到具体的构象信息。此时可以考虑下列方法：1）作变温实验，使体系温度降低，如果样品在溶液中有优势构象，可能得到NOE结果。2）加入使溶液变稠的物质，如SDS(十二烷基磺酸钠)，使得构象转换的速率降低。3）将样品分子作化学修饰，即将其结构稍加变化以便测定NOE。,其它种类的二维核磁,HOHAHA（同核全相关谱）: 测定样品分子中所有偶合质子关系的化学位移相关谱。 GHSQC（检测1H的梯度增益异核

10、单量子相关谱） 测定样品分子中，碳氢的直接相连关系。 COLOC（检测1H的异核远程相关谱） 测定样品分子中，中远程碳氢相关关系。 INADEQUATE（低丰度核双量子跃迁实验） 测定样品分子中，低丰度核的相关关系。,常见核磁原子核的化学位移范围,1H TMS 0-15 13C TMS 0-220 15N NH3（l） 0-900 17O H2O -50-1700 19F CFCl3 -280-250 29Si TMS -380-80 31P 85H3PO4 -480-270,14N and 15N NMR,15N能够产生很尖锐的核磁信号，但灵敏度很低。 14N灵敏度相对较高但核磁信号峰非常宽

11、，以至于在很多情况下无法分析。,14N and 15N NMR,14N NMR,I=1 Natural abundance 99.63% Reference compound NH3 liquid Receptivity rel. to 1H at natural abundance 1.01 10-3 Receptivity rel. to 13C at natural abundance 5.74,14N NMR,14N的高对称性小分子的信号宽度一般在几十或几十赫兹的范围内，而不对称的大分子的峰宽可能达到1000赫兹上下。因此一般用来区分很小的分子和N2。,15N NMR,15N的灵敏度非

12、常低，但可以得到尖锐的信号。 一般使用很大浓度的溶液或同位素标定的化合物进行研究。 驰豫时间一般很长（几十秒），需要长的d1，或添加驰豫试剂,I=1/2 Natural abundance 0.37% Reference compound 90% CH3NO2 in CDCl3 or liquid NH3 Receptivity rel. to 1H at natural abundance 3.85 10-6 Receptivity rel. to 13C at natural abundance 0.0219,15N NMR,15N NMR spectrum of sodium azide

13、 (1M) in D2O,15N NMR spectrum of enriched HIV-1 protease,31P NMR,I=1/2 Natural abundance 100% Reference compound 85% H3PO4 in H2O = 0 ppm Receptivity rel. to 1H at natural abundance 6.67 10-3 Receptivity rel. to 13C at natural abundance 37.7,化学位移值交叉，规律性不强， 要多查阅文献数据。,PBu3 -32.5 ppm PiBu3 -45.3 ppm Ps

14、Bu3 7.9 ppm PtBu3 63 ppm,31P NMR,与质子的耦合使峰变宽,一键耦合常数为200-700Hz，二键耦合常数为0.5-20Hz。,29Si NMR,29Si NMR,TMS,SiHCl3,一键耦合常数一般在几百赫兹的级别上。二键耦合常数为6.6Hz。,29Si-NMR spectrum of TMS in CDCl3,19F NMR,I=1/2 Natural abundance 100% Reference compound CFCl3 = 0 ppm， CF3COOH = -78.5 ppm Receptivity rel. to 1H at natural abundance 0.83 Receptivity rel. to 13C at natural abundance 4716,19F NMR,金属有机核磁,Organolithium,6Li : Q=8.0*10-4a=7.4%I=1 6Li : Higher resolution 7Li : Q=4.5*10-2a=92.6%I=3/2 7Li : Higher sensitivity Ref: 1M or 0.1M LiCl in D2O,金属有机核磁,Boron,10B : Q= 8.5 * 10-2 a=19.6%I=3 11B :