第五章金属酶

1、1,第一节 生物体的氧化还原反应 第二节 血红素蛋白 第三节 铁蛋白（贮铁）与铁传递蛋白 （运送铁） 第四节 铁硫蛋白 第五节 铜蛋白 第六节 维生素B12和B12辅酶 第七节 钼酶氧化还原酶,第五章 生物氧化还原反应中的 金属蛋白和金属酶,2,第一节 生物体的氧化还原反应,氧化还原反应是生物体内的重要反应 一 、分子氧及其活化 根据分子轨道法。氧分子轨道由两个氧原子轨道组成： O2KK(2S)2(2S*)2(2Px)2(2Py)2(2Pz)2(2Py*)1(2Pz*)1,3,若在反键轨道上加入一个电子，则可以成为超氧离子O2-； 若在反键轨道上加入两个电子，则可以成为过氧离子O22-； 若氧

2、分子失去一个电子，则可以成为双氧阳离子O2+。 O2-和O22-的键能比O2低，表明 O-O 键能削弱了，故可把O2-和O22-看为双氧的两种活化态。,4,O2在热力学上是一个强氧化剂 EO2/ H2O = 1.23 V 实际上它同大多数底物在室温的气相或均相溶液的反应进行得很慢，这是由于动力学上的原因,5,在生命体内，氧具有高度活性，这是由于存在过渡金属配合物催化剂的原因。有人认为，这是由于O2分子和底物E均可和金属离子反应形成三元配合物 O2-M-E，其中氧分子与过渡金属M形成一个键，还可能形成d-p*（反馈键），底物E若有对称合适的轨道，就可和金属的d轨道成键，形成O2-M-E一个扩展的

3、分子轨道，使电子能顺利地从底物转移到氧分子，实现氧化还原反应。,6,分子氧与过渡金属可以以侧基配位，端基配位和端基角向配位。以侧基配位时，分子氧的*轨道简并通过配体场的作用而消除，这将有利于消除自旋守恒对反应的限制，使电子容易成对地转移到分子氧的反键轨道。如果中心金属能程度不同地把电子转移给O2，则配位双氧可变为超氧型或过氧型配体，O2就被不同程度地活化了。,7,(2)两类脱氧反应: SH2 + 1/2 O2 S + H2O SH2 + O2 S + H2O2 实际上这两个反应要经过一个或多个中间氢载体，并以氧作为末端氢受体的体系来进行，实际上也是一条电子传递链。,8,(3) 底物与氧分子的氧

4、原子结合 这类氧化还原反应要相应的加氧酶参与。 总之，脱氢过程中脱去一个氢原子，加氧反应常伴有氧分子接受质子和电子而被还原为水。生物氧化的主要方式是脱氢作用，在依靠氧气生存的生物体内，从代谢物脱下的氢通过呼吸链的逐步传递最后被分子氧接受并生成水。,9,三、氧化还原酶的分类及其催化的反应,氧化还原酶是六大酶之一，它们大部分与金属离子有关。这类酶在生物体内的氧化还原产生能量、解毒及某些生理活性物质形成过程中起重要作用，氧化还原酶习惯上分为四类。,10,1. 脱氢酶 辅酶：NAD、NADP，这些酶受氢或提供氢,脱氢酶,S + AH2,A为受氢体，SH2和S为底物还原型和氧化型。大部分脱氢酶需要辅酶，

5、即为结合酶。脱氢酶的辅酶主要为NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）或 NADP（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸），少数为FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）或黄素单核苷酸（FMN）。,SH2 + A,11,这些辅酶起供氢或受氢作用，例如含锌的L-苹果酸脱氢酶可催化苹果酸脱氢反应：,苹果酸脱氢酶,L-苹果酸,草酰乙酸,谷氨酸脱氢酶，乳酸脱氢酶均为锌酶，黄嘌呤脱氢酶为钼铁酶。,12,2. 氧化酶,当脱氢酶的氢受体是分子氧时，称为氧化酶，氧化酶催化两类反应。 SH2 + O2 S + H2O2,这类酶的催化产物为H2O2， 另一类酶催化产物为H2O。,SH2 + 1/2 O2,S + H2O,13,3. 过氧化物酶,过

6、氧化物酶催化以H2O2为氧化剂的氧化还原反应。 SH2 + H2 O2 S + 2 H2O 过氧化氢酶催化H2O2 的歧化反应。 2 H2 O2 O2 + 2 H2O,过氧化物酶,过氧化氢酶,14,4.加氧酶,加氧酶催化氧分子的氧原子直接加合到有机物分子中，分为双加氧酶和单加氧 酶。 双加氧酶: SH2 + O2 S O2H2,双加氧酶,顺，顺己二烯二酸,15,单加氧酶，又称羟化酶。,R3CH + O2 + AH2,R3COH + A + H2O,肝微粒体单加氧酶,NADPH 为还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸, 肝微粒体单加氧酶为一与细胞色素p450有关的单加氧酶，p450（存在于肝脏浓度最

7、高）为血红素辅基酶蛋白。,16,四、呼吸链与电子传递体,1.呼吸链 生物体的各种运动均需要能量，这种能量来源于糖、脂肪、蛋白质等有机物在体内的氧化。这些有机物在活细胞内氧化分解，产生CO2和H2O并放出能量的作用称为生物氧化。,17,有机物在生物体内的生物氧化与在体外化学氧化的产物和能量变化相同，即产物均为CO2和H2O，并释放出相等的能量，不同的是，生物氧化是在活细胞内由酶催化，经一系列的化学反应（分步反应）逐步氧化，分次放出能量，这些能量主要以三磷酸腺苷（ATP）等高能化合物的形式储存起来，供需要时使用。故ATP是生物体的能量“储存库”和“转运站”。,18,2.电子传递体 (多种),在呼吸

8、链中，一类称为电子传递体的物质，通过自身的氧化还原作用传递氢和电子，把呼吸链起始的脱氢酶和末端的氧化酶连接起来。主要包括黄素蛋白、细胞色素、铁硫蛋白和某些脂溶性维生素。 黄素蛋白含黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）或黄素单核苷酸（FMN）辅基，黄素蛋白有的是脱氢酶，有的是氧化酶，还有的为电子传递体。,19,细胞色素是含铁卟啉辅基的蛋白，其主要功能是传递电子。在某些情况下，还具有氧化酶或加氧酶的功能。细胞色素的种类很多，从高等植物中至少可以分离出5种，即细胞色素b, c1, c, a, a3。 铁硫蛋白包含一个或多个 FeS簇，主要功能是传递电子。 脂溶性维生素中，最主要的电子传递体是富酶Q，它通过结

9、构的可逆改变传递电子。,20,第二节 血红素蛋白细胞色素c 血红素c类；细胞色素p450 血红素b类,铁蛋白可分为血红素蛋白和非血红素蛋白。 血红蛋白和肌红蛋白都含有血红素辅基（铁（）卟啉），人体中70%的铁以血红蛋白 形式存在，本节介绍在生物氧化还原过程中作为酶或电子传递体的一些血红素蛋白。,21,血红素辅基（铁（）卟啉）,Cytochrome_C_Oxidase_1OCC_in_Membrane,22,一. 细胞色素 血红素蛋白，传递e，H。有a，b和c三大类，根据其还原型光谱最大吸收峰的位置来分类，还原态有3个吸收峰，分别为、谱带，其中的谱带从细胞色素a（570nm）、b(555-560

10、nm)到c(548-560nm)变短。,23,1. 细胞色素c,细胞色素c分子较小，易于结晶，其组成和结构已研究清楚。 细胞色素c：血红素C + 相应蛋白构成。 血红素c以共价键与蛋白链中的Cys相联,24,二细胞色素p450 （简称p450 ),属一类b族细胞色素，用p450表示，以别于其它b族细胞色素（血红蛋白、肌红蛋白） 药物、农药、工业污染物等通过呼吸，口及皮肤进入人和动物体内，动物体通过消化道排除大部分污染物，通过尿液排出大部分水溶性污染及毒素。但脂溶性物都很难由以上两途径排出，人体肝脏弥补了这一缺陷，肝脏有很强的解毒功能，它主要通过肝脏中的p450混合功能氧化酶系统发挥作用。,25

11、,P450是一种特殊的血红素蛋白，它的还原型（Fe(II)）与CO结合在450nm处有最大吸收峰，因而命名为细胞色素p450。p450是一类具有不同分子量不同性能的血红素蛋白。,26,1. P450 的功能 P450广泛存在于动物、植物及微生物体内，参与许多代谢过程，人体肝、肾、脑及皮肤中浓度最高，目前所知，p450在动物体中（哺乳动物）可以催化近300种各种脂溶性化合物进行氧化还原反应。羟化、环氧化等，各种脂溶性化合物经p450催化氧化还原后，变为水溶性化合物，经肾脏、尿液排出体外解毒作用，这是有利的一方面；但另一方面，有些化合物经p450催化氧化还原反应后，毒性反而更高，如黄曲霉素、亚硝胺

12、、致癌物3，4苯并芘等，毒性不大，但催化氧化还原后，毒性大大的增加。,27,2. 两类含p450的单加氧酶体系 由传递电子链不同将p450分二类。A、 2H+ + O2 + S + 2e H2O + SO NAD（P）H + H+ NAD（P）+ + 2H+ + 2e,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,产生的2电子经NAD（P）、黄素蛋白还原酶FAD、还原蛋白中的铁硫中心Fe2S2，把电子传到p450血红素活性中心，p450血红素催化上述反应。,28,B、 2H+ + O2 + S + 2e H2O + SO 单加氧 NAD（P）H + H+ NAD（P）+ + 2H+ + 2e,烟酰胺腺嘌呤二核苷酸

13、磷酸,产生的2个电子经更复杂的黄素蛋白还原酶（黄素腺嘌呤二核苷酸FAD、黄素单核苷酸FMN），把电子转移到p450血红素中，p450催化上述氧化还原反应发生。,29,3. P450的结构,半胱氨酸：, 氨基硫基丙酸,大多数p450相对分子质量为50000，含氨基酸残基400多，每一条蛋白链都与一个血红素相连，平面四个氮原子与Fe（）配位，第5配位原子是半胱氨酸残基的硫，不同的p450，第5配位的蛋白链的半胱氨酸硫的位置不同，第6配体仍未确定。,30,已测定多种p450的结构，如单胞菌的莰酮5外羟化酶的p450（p450cam），兔肝p450 LM2和鼠肝p450的某些结构特征见表,31,4.

14、双氧活化和底物羟化作用,有机物与氧反应，需高温，在生物体内，由于有p450酶的催化，可使氧分子活化：,32,(1). 高自旋的p450与底物RH结合形成低自旋的RH Fe（），处于平衡态 : Hi Fe（） t2g3eg2 t2g5eg0 low Fe（） t2g4eg2 t2g6eg0 低自旋p450的第6配位可能是含OH基团（如氨基酸中的OH），而高自旋态的p450第6配位空着，这时的铁高出卟啉环平面，高自旋p450与底物RH结合。,33,(2).NAD（P）HP450（烟酰胺腺）还原酶使NAD（P）H的电子转移至p450血红素铁卟啉，使Fe3+还原为Fe2+。 (3).分子氧结合到p45

15、0上，形成三元配合物(Fe2+为中心，卟啉N（4个），半胱氨酸的S及分子氧)。 (4).第二个电子离开NAD（P）H还原酶，形成不稳定的过氧化物FeOO。 (5).过氧化物与H+结合，形成H2O和配合物RH（FeO）。 (6).ROH脱出后，又形成了氧化型p450，使循环闭合。,34,5.P450的模拟研究,石油化工生产中，环氧化物及酯需复杂和苛刻的工艺. P450具有室温催化氧化，p450具有高效专一催化多种有机物和分子应，但结构复杂，不易制取。 人们提出了多种模拟体系，主要有三种组分：催化剂、氧化剂和添加剂。,35,P450含血红素b辅基，血红素辅基与金属卟啉结构相近，很多人研究含铁卟啉体

16、系；自证实p450活性中心含硫基配位后，许多模拟改用卟啉加硫醇体系，来进行有机分子的常温氧化，均取得成效。,血红素b,36,三过氧化物酶和过氧化氢酶,多数以血红素辅基（铁卟啉）的酶，蛋白为糖蛋白 1. 过氧化物酶 催化反应 SH2 + H2O2 S + 2 H2O,过氧化物酶,37,细胞色素c过氧化物酶催化H2O2分解为H2O。 2（cyt.c）Fe（） + H2O2 2（cyt.c）Fe（） + 2 H2O 注：Ccp：细胞色素过氧化酶：为细胞色素a和a3复合体辅基为血红素a（比较血红素b和血红素C）,Ccp,H+,38,对大多数组织来说，H2O2有害，H2O2可氧化含巯基的酶或蛋白质，使之

17、失去活力，将体内不饱和脂肪酸氧化为过氧化物，会产生疾病，如发生溶血症等，过氧化物酶催化H2O2转化为 H2O，从而消除了毒性。,39,2.过氧化氢酶 过氧化氢酶活性不及过氧化物酶，但它催化 H2O2 H2O + O2是高效的，过氧化氢酶为结合蛋白，由高铁血红素辅基和相应的蛋白组成，相对分子量24000，每个分子含4个亚基，每一个亚基含一个高自旋正铁血红素铁()的轴向配体可能是氨基酸和H2O。 蛋白+血红素辅基, 4个亚基，含4个Fe()卟啉,40,第三节 铁蛋白（贮铁）与 铁传递蛋白（运送铁）,为非血红素铁蛋白，不含血红素辅基，但含铁，在这一类蛋白质中，铁有多种存在形式，按生理功能的不同，将非

18、血红素铁蛋白分成如下几类：（四类）,41,一些非血红素蛋白的生理功能,42,一.铁蛋白,主要存在与动物脾脏、肝脏和骨髓中，在植物叶绿体及某些细菌中也发现有铁蛋白。主要功能为贮存铁。 铁蛋白以Fe()离子的微团为核心，微团的组织成分大致是(FeOOH)8(FeOPO3H2)微团中有20004000个铁离子，外围被24个相同亚单位组成的脱铁铁蛋白包围着。,43,铁贮存： Fe2+ -e Fe3+ nFe3+ + 脱铁铁蛋白 铁蛋白 铁释放： 铁蛋白 + ne 脱铁铁蛋白 + nFe2+,O,44,二.铁传递蛋白,存在：动物体和细胞中； 功能：运送Fe()； 组成：金属糖蛋白；,1945年首次在人血

19、清中发现。,45,存在：主要血清中。,铁传递蛋白为金属糖蛋白，不同动物的铁传递蛋白，其氨基酸组成和糖含量不同。相对分子量是6700074000，人血清铁传递蛋白是由一条含676个氨基酸残基的肽链和两条相同的糖支链组成，主要功能是运送Fe(III)离子。,46,铁传递蛋白的生理功能：,主要是在体内运送Fe3+离子，铁传递蛋白存在两个结构域，(600700氨基酸残基，M7万，2个相同糖支链)，各有一个结合金属的部位，分别称为A位和B位，A位结合的铁主要运送到骨髓和胎盘，B位结合的铁主要运送到肝细胞、小肠粘摸和其它组织细胞。,47,Fe（）,Fe（）,血液,Fe（）,Fe（）+ 脱铁蛋白,小肠、胃中

20、,还原,十二指肠,等粘膜,O,CO2脱铁蛋白,（铁传递蛋白）,A部位,B部位,骨髓细胞 (用于血红蛋白合成)， 或各组织用于合成酶,肝脾脏（贮存Fe（）,食物和饮料中铁的吸收,48,第四节 铁硫蛋白,传递电子，参与生物体内各种氧化还原反应 为一类含FeS发色团的非血红素铁蛋白，利用铁的可变价，进行电子传递作用。 根据氧化还原反应中心的组成和结构，铁硫蛋白可分为三大类： 1. Fe(Cys)4 蛋白； 2. Fe2S*2(Cys)4 蛋白； 3. Fe4S*4(Cys)4 蛋白. (Cys-半胱氨酸),49,1.Fe(Cys)4蛋白红氧还蛋白,以 Fe(Cys)4为中心的蛋白呈红色，故称红氧还蛋

21、白，主要存在于细菌中，分子量并不高：6000，一般只含5060个氨基酸残基，在肽链中，4个半胱氨酸的硫基硫配位。 功能：传递电子。,50,红氧还蛋白（产生小球菌）结构示意图4个半胱氨酸的S与Fe配位Cys的6，9，38和41位S，第6，9，38和41位的半胱氨酸硫基硫与Fe()配位,红氧还蛋白,植物型铁氧还蛋白结构,51,2. Fe2S*2(cys)4蛋白植物型铁氧还蛋白,Fe2S*2(cys)4来源于植物的叶绿体，参与光合作用，故称为植物型铁氧还蛋白，S*表示无机S成活性S。 氨基酸残基有9个，其中有5个Cys，分别位于18，39，44，47，77，均用S与Fe配位。,52,3. Fe4S*

22、4(cys)4蛋白高电位铁硫蛋白和 细菌型铁氧还蛋白,该类铁硫蛋白以Fe4S*4(cys)4为活性中心，来源不同，含活性中心数可能不同。如：从酒色着色菌分离出的铁硫蛋白含1个Fe4S*4(cys)4活性中心，4个Fe和4个S*交替连接成立方烷结构，每一个Fe与一个cys连结（巯基） 产生于小球菌铁氧还蛋白分子含有二个Fe4S*4(cys)4活性中心，二者相距1.2nm，作用为传递电子。,53,第五节 铜蛋白,铜蛋白的生理功能：载氧血蓝蛋白，传递电子，贮存铜，作为氧化酶。 人体各组织的正常代谢都需要铜，肝、脑、心、肾和脾中含铜高。铜以配合物的形式存在。胆和胆汁是过量铜排出的渠道和介质。,54,含

23、型铜的铜蛋白在可见光600nm处有吸收峰，本身显蓝色，这可能是LM荷移光谱，型铜是顺磁性的，型铜处于畸变四面体配位环境中，有较高的氧化还原电位。 型铜对吸收光谱没有明显作用，也是顺磁性，接近四方锥构型。 型铜是反磁性，成对的Cu()- Cu()由于强烈的自旋-自旋相互作用而不产生EPR（电子顺磁共振）讯号。,55,第六节 维生素B12和B12辅酶,维生素B12是重要的含钴的生物化合物，是天然存在的最复杂的配位化合物之一。存在于动物体及细菌中，动物体内维生素B12从食物中来，另外肠道细菌也可合成vitamin B12，治疗恶性贫血有效. 人和动物本身不能合成维生素B12。 1948年分离出它的氰

24、化配合物，经结构测定，其组成和结构已较清楚。,56,一维生素B12及其衍生物的结构,57,配位于低自旋钴()（3d6 t2g6eg0）的4个吡咯氮原子几乎在同一平面上；第5位配体位于咕啉环平面的下方是核苷酸的苯并咪唑氮；第6位配体x可变。凡第5位配位的配体为二甲基苯并咪唑核苷酸者统称为钴胺素（cobalamins）。 第6位配体是CN-，称氰钴胺素，维生素B12，为H2O，称水合钴胺素或B12a或H2O-B12，为甲基，甲基衍生物甲基钴胺素Me-B12，为腺嘌呤核苷酸，称腺苷钴胺素（Ado-B12），是一种活性很高的辅酶，又称辅酶B12。,58,甲基钴胺素和腺苷钴胺素都有CoC键，是自然界中罕

25、见的有机金属化合物。 哺乳动物肝脏中的维生素B12近80%以辅酶形式存在，维生素B12在体内的功能为通过辅酶B12参与碳的代谢作用，促进核酸和蛋白质合成，叶酸储存，硫醇活化，骨磷脂形成，促进红细胞发育与成熟。,59,二. 钴胺素的性质与功能,1.钴胺素的氧化还原作用,上述钴胺素都是反磁性物质，具有低自旋d6构型，Co的氧化态为+3，在适当条件下 ，Co()可以还原为Co(II)或Co(I)。如用弱还原剂抗坏血酸，可以使钴胺素中 Co()还原为Co()胺素(顺磁性)，常用B12r表示；如用四硼氢化钠或四氢铝锂还原，则可使Co()胺素进一步还原为Co(I)胺素B12s。,60,2. 甲基转移反应

26、B12重要功能是参与合成蛋氨酸 在B12作用下，可使一分子的甲基转移到另一分子上。,CH3THF + HSCH2CH2CHCOOH,THF + CH3SCH2CH2CHCOOH,NH2,NH2,（ 甲基四氢叶酸 ）,（高半胱氨酸）,（蛋氨酸）,61,从一些微生物可分离出甲基B12(MeB12)，它参与汞甲基化反应，使汞盐转化为剧毒甲基汞。,Me-B12 + Hg2+,MeHgMe + H2OB12,某些细菌中发现，MeB12是合成甲烷的良好底物：,CH3B12 + (M),（辅酶）,B12r + CH3(M),CH3(M) + H2,(M) H + CH4,62,3.分子内重排反应：,R2 H R1CCR3 H H,辅酶B12,H R2 R1CCR3 H H,63,三. 模拟物研究,维生素B12在体内主要功能为通过辅酶B12参与碳的代谢作用，促进核酸和蛋白质合成，叶酸储存，硫醇活化，骨磷脂形成，促进红细胞的发育与成熟。 B12最为显著的特点之一是形成烷基衍生物的能力，烷基钴胺素中的烷基R碳原子与钴原子主要以键合，属于有机金属化