第三章2 转录的延伸、终止以及RNA的加工.ppt

1、一、转录的延伸 RNA链延伸的基本过程 RNA链延伸的暂停 RNA链延伸的再次启动,第二节 转录的延伸、终止及RNA加工,RNA链延伸的基本过程,核苷酸加到RNA链的3-OH上，RNA链延长。,RNA polymerase changes size at initiation,RNA链的延长，不是以恒定速度进行的,RNA链延伸的暂停 链延伸的速度不是恒定的，在DNA的某些区域，转录速度减慢或停止，常发生在富含GC区。,RNA链延伸的再次启动 被停止的RNA聚合酶可以再次启动，通过剪切RNA转录产物产生的3端重新开始转录。切除反应需除RNA聚合酶以外的一些因子参与。,A stalled RNA

2、polymerase can be released by cleaving the 3 end of the transcript.,RNA polymerase can recover from pausing,RNA polymerase during elongation,RNA polymerase is stalled & backtracks,3 region of RNA is cleaved,New 3 end is located in catalytic site,Catalytic site resumes elongation,1、转录终止概述,终止时,核苷酸不再添加

3、到延伸的RNA链上，开放三元复合物解体。 终止可能既需识别终止序列，也需RNA产物的发夹结构。,二、原核生物转录的终止,2、大肠杆菌的两类终止子,终止子（terminator） 不依赖因子的终止（Rho-independent） 无其他因子参与，核心酶能在某些位点终止转录。 依赖因子的终止 （Rho-dependent）,终止子结构,1) 二级结构中的发夹(长度7-20 bp) 靠近基部通常有一个G-C富集区。 2) 转录单位最末端对应的DNA有连续4-8个A组成的片段。 在大肠杆菌基因组中，符合这些标准的序列约有1100个，这暗示了约一半基因拥有不依赖因子的终止子。,终止需要的DNA序列位于

4、终止位点序列之前； RNA发夹结构的形成可能是必要的。,不依赖因子的终止,依赖因子的终止,因子的基本结构,因子是大肠杆菌的一种蛋白质，只在RNA合成终止阶段发挥作用，是一种NTP酶， 具有RNA-DNA 解旋酶活性。分子量2105 ，六聚体蛋白。 作为RNA聚合酶的辅助因子行使功能。大肠杆菌中的依赖因子的终止子占所有终止子的一半左右。,Rho has an N-terminal RNA-binding domain and a C-terminal ATPase domain. A hexamer in the form of a gapped ring binds RNA along the

5、 exterior of the N-terminal domains.,依赖因子的终止子GC含量低，使延宕时间变短； 回文序列下游缺乏连续的A/U,RNA Pol转录DNA,因子附着到RNA上游（约70 nt）,因子跟在RNA Pol后沿RNA移动，ATP供能,RNA Pol在终止位点停下，并被因子追上,因子使DNA-RNA双链解开，转录终止，释放RNA Pol、子 和 RNA, 因子的作用机理,“热追踪（hot-pursuit）”模型：,三、真核生物RNA转录的终止,(1) RNA聚合酶在18个碱基形成的终止子序列处终止转录；,(2) RNA聚合酶终止位点的专一性可能不强，终止一般发生在产

6、生成熟mRNA（专一序列切割处）3端下游1000 bp 以外的位点上。终止位点二级结构的形成可能比具体的碱基序列更重要，可能需要一段富含AT的序列。,(3) RNA聚合酶转录在RNA末端处终止。RNA末端富含GC序列中的寡聚T（4个以上）是终止信号，RNA聚合酶在此处终止转录。 除聚合酶本身外，似乎不需要其它蛋白质因子参与转录的终止。,四、抗终止,1.破坏终止位点RNA的茎-环结构,结构基因,前导序列,AA密码子,2.依赖于蛋白质因子的转录抗终止, 噬菌体 抗终止蛋白N：与DNA茎环区结合；NusA：与聚合酶及N结合；NusB、S10和其它蛋白改变聚合酶构象，使其对前面的终止信号不敏感。,转录

7、终止信号,抗终止位点,启动区,Antitermination extends the transcription unit,抗终止蛋白作用在RNA聚合酶上，使之越过特定终止子而通读,五、原核生物与真核生物mRNA的特征比较,1、转录发生的部位 2、结构特征 3、生命周期,1、转录发生的部位,细菌mRNA的转录和翻译发生在同一细胞空间；转录、翻译、降解间隔时间很短，或者几乎同步进行。 真核生物mRNA合成与成熟完全在细胞核内发生，而翻译在细胞质中完成；其转录、翻译、降解三者间间隔时间较长。,原核生物mRNA (1) 许多是以多顺反子形式存在； (2) 5端无帽子结构； (3) 3端没有或只有较短

8、的poly(A)。起始密码AUG上游7-12个核苷酸处有一被称为SD (Shine-Dalgarno sequence)的保守区，与16S rRNA 3端保守核苷酸反向互补。 rRNA保守区：3-UCCUCC-5,2、结构特征,真核生物mRNA结构特征,(1) 许多是以单顺反子形式存在；,(2) 真核生物mRNA的5端存在“帽子”结构,转录始于核苷三磷酸（经常是A或G）。 初始序列： 5pppA/GpNpNpNp 加工后序列：5GpppA/GpNpNpNpNp,5 Gppp+pppApNpNp 5GpppApNpNp+PP+P,加帽反应非常迅速，mRNA几乎一诞生就带上帽子了。,鸟苷酸转移酶,

9、帽子覆盖了mRNA的5端，它可在几个位点被甲基化,G,A,A,Guanine-7-methyl-transferase,2-O-methyl-transferase,Cap 0,1015%,100%,mRNA 5末端帽子特征的生物学功能：,I: 使mRNA免遭核酸酶的破坏，保持其结构的稳定性； II: 有利于蛋白质合成起始因子的识别，从而促进翻译的起始。,高等真核生物（除组蛋白基因）的mRNA， 3端具有poly(A)尾巴，长度40200 bp。,(3) 绝大部分真核生物 mRNA 3端含poly(A) 尾巴,AAUAAA,CA,mRNA前体：,5,3,1530 bp,AAUAAA,CAAAA

10、A,5,3,多聚A合成酶,0.5-2 kb,生物学功能： I: 保持mRNA的稳定性，防止被降解； II: 与翻译起始有关。,真核细胞中仍可有多达1/3没有poly(A)的mRNA。,应用一：Poly(A)用来从总RNA中分离mRNA,可设计寡聚Oligo (dT)片段合成cDNA,应用二：,mRNA: 5 NNNN.NNNNNNAAAAA 3 TTTTT 5 ,cDNA: 3 NNNN.NNNNNNTTTTT 5 ,(4) 真核生物mRNA中常含有内含子,Eukaryotic mRNA is modified, processed, and transported,3. 生命周期,原核生物m

11、RNA寿命较短，通常只能翻译几分钟； 真核生物mRNA寿命较长，可持续翻译几小时。,六、转录后加工,转录后加工（posttranscriptional modification） （1）减少部分片段：如切除mRNA 3端拖尾序列和中部的内含子； （2）增加部分片段：5加帽，3加poly(A) 和通过编辑加入一些碱基等； （3）修饰：对某些碱基进行甲基化等修饰。,（一）tRNA的加工 （二）rRNA的加工 （三）mRNA的加工,（一）tRNA的加工,1. 原核生物tRNA的加工 参与蛋白质合成的tRNA不是最初的转录产物 (1) 它们的5端都是单磷酸，而原始的转 录产物5应是三磷酸； (2) 最

12、终的tRNA分子比初始转录物小； (3) tRNA含有特殊的碱基，这些碱基是通过一些化学修饰产生的。,tRNA加工时需要多种核酸酶参与： 如：RNase D、E、F和P等，RNaseP主要在tRNA的5起作用。它由蛋白质和RNA组成，它不识别特殊序列，只识别二级结构。 RNaseD主要负责切除3序列。 tRNA核苷酸转移酶，催化3末端的CCA的生成。,（1）识别发夹结构的内切核酸酶切断RNA链； （2）RNAaseD识别CCA末端序列，一个一个除去七个核苷酸。 （3）内切核酸酶P切断RNA，形成5末端； (4) RNAaseD除去3末端的二个核苷酸，形成3-OH末端。,加工过程,缺-CCA的t

13、RNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。 (5) 修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假 尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨 基酸臂的4-硫尿苷，D臂的2甲基鸟苷，TC臂的假尿 苷（）和反密码子环上的2异戊 腺苷。,2. 真核的tRNA的加工,真核tRNA的基因和原核生物的异同： (1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成 簇排列，基因间有间隔区； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多 得多，如酵母约有400个tRNA基因； (3)增加了剪接内含子的过程。 (4)都要加CCA。,真核tRNA内含子的特点：,位置相同，都在反密码子环的下游； 不同tRNA的内含子长度和序列各异； 外显子和内含子

14、交界处无保守序列； 内含子和反密码子配对形成茎环。,真核tRNA内含子切除的特点：,(1)没有保守的交界序列； (2)剪切反应的信号是二级结构，而不是一级结构； (3) 依赖于蛋白质的Rnase起作用。,（二）rRNA的加工,1. 原核rRNA的加工 大肠杆菌中具有7个编码rRNA的操纵子； 原初转录物30S，由5S、16S、23S rRNA和一些 tRNA构成； Rnase III 参与rRNA加工。,2.真核生物rRNA的加工 45S 前体rRNA形成后立刻与蛋白质结合，加工发生在核糖体上，而不是游离的rRNA上。 (1) 切除5端的前导序列； (2) 从45S的中间产物中先切下18S的片

15、段。,(三)前体mRNA转录后的加工,mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。,1.真核mRNA前体的加工 核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA, hnRNA）平均分子长度为8-10 kb (2 Kb-14 kb)左右。hnRNA是mRNA的前体，比mRNA的平均长度（1.8-2 kb）要大4倍多。,2、真核mRNA的加工步骤 一般要经过四步： （1）5加帽（capping）； （2）3加尾（tailing）： (50-200 bp) （3）内含子的剪接（splicing） （4）修饰：对某些碱基进行甲基化。 （5）编辑 (edit

16、ing),（）加尾,A、特殊组分识别AAUAAA，特殊组分含3个亚基。 在剪切3末端和进行多腺苷化反应中都需要这种特殊组分。,B、剪切因子(CF) AAUAAA处下游1530 bp处剪切RNA； C、末端腺苷转移酶poly(A)聚合酶合成poly(A)尾巴；,3.内含子的剪接、编辑、再编码及化学修饰,（1）RNA中的内含子 （2）mRNA的剪接 （3）RNA的编辑、再编码及化学修饰,（1）RNA中的内含子,用DNA RNA杂交方法验证鸡卵清蛋白基因中存在非编码的内含子区,鸡卵清蛋白的基因结构示意图,Chambon等发现内含子切割位点有2个特点,1）内含子的两个末端并不存在同源或互补。 这就排除

17、了存在二级结构的可能。 2）连接点具有很短的保守序列，称为边界 顺序。其规律称为GU-AG法则（GU-AG rule) 或Chambon法则。 左边的剪接位点称供体（donor）位点， 右边的剪接位点称受体（acceptor）位点。,除边界序列外，外显子与内含子交界处的序列以及内含子内部的部分序列也可能参与内含子的剪接。,生物体内的各种内含子,Cech等1981年从四膜虫中分离得到35S的前体rRNA，含有长413 bp的内含子。 体外：一价或二价阳离子及GTP可释放413 bp的线性内含子。 若继续保温，则线形内含子可形成环状RNA，意味着35S rRNA在GTP的作用下可以自我剪接。,I

18、类内含子的剪接核酶的发现,核酶(Ribozyme) “Ribozyme”是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。 与传统酶的区别： 1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或含有蛋白的RNA； 2)核酶既是催化剂又是底物，而酶仅催化反应。,I 类内含子：前体rRNA基因（极少数单细胞真核生物）、一些线粒体基因，少数原核生物基因。结构特点：1）边界序列为5U-G 32）具有中部核心结构即由4个10-12 bp保守序列形成一定的二级结构。3）具有内部引导序列（internal guide sequence, IGS）(内含子中与外显子配对的序列，决定剪辑的专一性),I

19、VS: intervening sequence,I类内含子的剪切机制 转酯反应：酯键从一个位置转移到另一个位置,核酶发现的意义,1）突破了酶的概念，是一种自体催化。 2）揭示了内含子自我剪接的奥秘；促进了对RNA的研究。 3）为生命的起源和分子进化提供了新的依据。,纯RNA RNA为主 RNA和 蛋白为主 纯蛋白 蛋白为辅 蛋白并重 RNA为辅 核酶 RNAaseP ？ 端粒酶 一般酶类,类内含子的剪接,类内含子主要存在于真核生物的线粒体和叶绿体rRNA基因中。,类内含子的结构特点 1) 边界序列为5GUGCGYnAU3。,2) 有6个茎环结构；功能区6（在内含子的 3端）含有612 nt保

20、守序列, 有1个不配对A碱基，其上带有2 -OH首先进行转酯反应。 该保守区也称为分支点序列branch-point sequence, BPS。,类内含子的剪接过程： 1）内含子本身的分支点A的2-OH 作为亲核基团攻击内含子5端的磷酸二酯键，从上游切开RNA链后形成套索结构。 无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在,2）上游外显子的自由3-OH作为亲核基团攻击内含子3位核苷酸上的磷酸二酯键，使内含子被完全切开。 3）上下游两个外显子通过新的磷酸二酯键相连，同时释放出套索状的内含子。,前体mRNA内含子的结构特点： 1） 边界序列:符合GU-AG法则。 2） 分支点序列：位于内含子3上游18-40

21、nt处，为Py80NPy87Pu75APy95其中A为百分之百的保守，且具有2-OH。 3）内含子5端有一保守序列可以和U1 snRNA的5端的保守顺序互补。,（2）mRNA的剪接,前体mRNA内含子的剪接 snRNA：真核细胞内存在许多种类的核内小RNA，100300 nt。 snRNP：U系列snRNA与多肽或蛋白质结合形成核糖核蛋白体，参与hnRNA的剪接。 U3-snRNA与rRNA前体的加工有关， U1、U2、U4、U5、U6与hnRNA的加工有关。 mRNA链上每个内含子的5和3端分别与不同的snRNP相结合，形成RNA和RNP复合物剪接体。,剪接过程： 1）U1snRNA以碱基互

22、补的方式识别mRNA前体5剪接点，和5位点结合。,2）剪接因子U2AF (U2 auxiliary factor)识别3剪接点，结合在3上游富含嘧啶区，并引导U2 snRNP 与分支点相结合，形成剪接前体。 3）U4，U5和U6三聚体snRNP与分支点相结合，形成60S的剪接体，进行RNA前体分子的剪接。,U6催化5位点的剪接， 5外显子的3-OH对内含子3切点进行转酯反应。 剪接机制 本身不能形成二级结构，必须依赖snRNP的帮助。 snRNP在剪接体中参与转酯，剪接反应。,有关RNA剪接的概念：,顺式剪接（cis-splicing）：剪接反应发生在同一个基因内，切除内含子，相邻的外显子彼此连接。 反式剪接（trans-splicing）：不同基因的外显子剪接后相互连接。 变位剪接：选择性剪接，剪接时，没有将所有的外显子都连起来，而是通过略去或改变某个剪接点使部分外显子作为内含子处理。,（3）RNA的编辑、再编码及化学修饰 RNA的编辑: 指转录后的某些RNA，在编码区发生核苷酸的加入，丢失或取代等现象。 因经过编辑的mRNA序列发生了不同于模板DNA的变化，它导致了DNA所编码的遗传信息的改变，因此是mRNA的一种加工方式。,1986.R.Benne在研究锥虫线粒体mRNA转录加工时发现mRNA的多个编码位置上加入或丢失尿苷酸。,1990年在高等动物和病毒中也发现了