酶工程制药课件

1、第六章,酶工程制药,第一节 概 述,一、酶的特性 酶是由活细胞产生的具有特殊催化 功能的一类蛋白质。其特点： 催化效率高 专一性强 反应条件温和 催化活性受到调节和控制,二、酶工程简介 酶工程是酶学和工程学相互渗 透结合发展而形成一门新的技 术学科。它是从应用的目的出 发研究酶、应用酶的特异性催 化功能，并通过工程化将相应 原料转化成有用物质的技术。,酶工程主要研究内容,酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发。 酶和细胞的固定化及酶反应器的研究。 酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究。 酶的分子改造与化学修饰以及酶的结构与功能之间关系的研究。 有机相中的酶反应研究。 酶的抑制剂

2、、激活剂的开发及应用研究。 抗体酶、核酸酶的研究。 模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成的研究。,第二节 酶的来源和生产,一、酶的来源 二、酶的生产菌 对菌种的要求 生产菌的来源 目前常用的产酶微生物,早期酶的生产多以动植物为主要原料,植物提供的酶主要有： 蛋白酶、淀粉酶、氧化酶等。 动物组织提供的酶主要有： 胰蛋白酶、脂肪酶和用于奶酪生产的凝乳酶等。,目前工业生产一般都以微生物为主要来源,利用微生物生产酶制剂，具有如下优点： 微生物种类繁多，酶的品种齐全。 微生物生长繁殖快、生产周期短、产量高。 培养方法简单，原料来源丰富，价格低廉。 微生物具有较强的适应性和应变能力，可以通过各种遗传变异

3、的手段，培育出新的高产菌株。 所以，目前工业上应用的酶大多采用微生物发酵法来生产。,酶的生产菌,作为一个优良的产酶菌种应具备以下几点要求： 繁殖快、产酶量高，酶的性质应符合使用要求，而且最好是产生胞外酶的菌。 不是致病菌，在系统发育上与病原体无关，也不产生有毒物质。这一点对医药和食品用酶尤为重要。 产酶性能稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体。 能利用廉价的原料，发酵周期短，易于培养。,生产菌的来源,从菌种保藏机构和有关研究部门获得。 从自然界中分离筛选。,目前常用的产酶微生物,大肠杆菌： 其遗传背景清楚，可被广泛用于遗传工程改造成为外来基因的宿主，而成为优良性状的“工程菌”。 枯草杆菌：是工业

4、上应用最广泛的产酶菌之一，主要用于发酵生产淀粉酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶等。 啤酒酵母：生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶等。 曲霉（黑曲霉和黄曲霉）： 糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶和脂肪酶等。,第三节 酶和细胞固定化,一、固定化酶的制备 固定化酶的定义： 固定化酶是指限制或固定于特定空 间位置的酶，具体来说，是指经物 理或化学方法处理，使酶变成不易 随水流失即运动受到限制，而又能 发挥催化作用的酶制剂。,固定化酶的特点 具有生物催化剂的功能，又有固相 催化剂的功能。 可多次使用 反应后，酶底物产物易分开，产物 中无残留酶，易纯化，产品质量高。,反应条件易控制

5、。 酶的利用效率高。 比水溶性酶更适合于多酶 反应。,酶和细胞固定化方法 酶和细胞固定化方法 载体结合法 交联法 包埋法 网格型 微囊型 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 热处理（细胞）,酶和细胞固定化模式,载体结合法 物理吸附法 离子结合法 共价结合法 交联法,物理吸附法,用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的一种固定化方法。 此类载体有： 无机载体活性炭、多孔玻璃、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等； 天然高分子载体淀粉、谷蛋白等； 其他大孔树脂、陶瓷等，具有疏水基的载体（丁基或己基 葡聚糖凝胶）。,离子结合法,离子结合法是酶通过离子键结合于具有

6、离子交换基的水不溶性载体上的固定化方法，此法的载体有多糖类离子交换剂和合成高分子离子交换树脂。,共价结合法,共价结合法是酶以共价键结合于载体上的固定化方法。 共价结合法与离子结合法和物理吸附法相比，其优点是酶与载体结合牢固，稳定性好，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。缺点是反应条件苛刻，操作复杂，而且由于采用了比较强烈的反应条件，会引起酶蛋白高级结构的变化，破坏部分活性中心。,包埋法 网格型 微囊型 选择性热变性法：此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理使细胞膜蛋白变性但不使酶变性而使酶固定于细胞内的方法。,酶和细胞的固定化载体 吸附载体 包埋载体 共价结合载体,固定化酶

7、制备技术 吸附法制备固定化酶技术 包埋法制备固定化酶技术 界面沉降法 界面聚合法 交联法制备固定化酶技术 共价结合法制备固定化酶技术,二、固定化细胞的制备 固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位 置的方法称为细胞固定化技术。 被限制或定位于特定空间位置的 细胞称为固定化细胞。,固定化细胞的特点 有细胞特性，生物催化剂功能， 固相催化剂特点。 优点： 无须进行酶的分离纯化 保持酶的原始状态，酶回收 率高,比固定化酶稳定性高 细胞内酶附助因子可再生 细胞本身含多酶体系 抗污染能力强,固定化细胞的制备技术 载体结合法 是将细胞悬液直接与水不溶性的 载体 相结合的固定化方法。 包埋法 将细胞定

8、位于凝胶网格内的技术。,交联法 用多功能试剂对细胞进行交联的固 定化方法。 无载体法 靠细胞自身的絮凝作用制备固定 化细胞的技术。,三、固定化方法与载体的选择依据 固定化方法的选择 固定化酶应用的安全性 固定化酶在操作中的稳定性 固定化的成本 载体的选择,四、固定化酶的形状与性质 固定化酶的形状 颗粒状固定化酶 纤维状固定化酶 膜状固定化酶 管状固定化酶,固定化酶的性质 酶活力的变化 酶稳定性的变化 操作稳定性 贮藏稳定性 热稳定性 对蛋白酶的稳定性,酶学特性的变化 底物专一性 最适pH 最适温度 米氏常数 最大反应速度,五、固定化细胞的形状与性质 固定化细胞的形状 固定化细胞的性质,六、固定

9、化酶活力的测定方法 酶活力:在单位时间内单位体积中 的底物减少量或产物增加量来表示。 分批测定法 连续测定法,第三节（2） 固定化酶和固定化细胞的反应器,一、反应器的类型和特点 间歇式搅拌罐反应器 用于游离酶反应后随即放料。 连续流动搅拌罐反应器 连续进料、连续出料,添充床反应器 固定化酶添充于床层内。反应器 内的流体的流动形态为平推流形。 底物以恒定流速通过反应床。,流化床反应器 底物以足够大的流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒处于流化状态，达到混合的目的。 循环反应器 部分反应液流出和新加入底物流入液混合，在进入反应床进行循环。 连续流动搅拌罐-超滤膜反应器 其它反应器,连续流动搅拌罐-

10、超滤膜反应器 由连续流动搅拌罐反应器和超滤装置组合而成的反应器。它在连续流动搅拌罐的出口处装有半透膜。 其它反应器,各种反应器的示意图,二、反应器的选择依据 根据固定化酶的形状来选择 根据底物的物理性质来选择 根据反应的动力学特性来选择,根据外界环境对酶的稳定性 的影响来选择 根据操作要求及反应器费用 来选择,第四节 酶的人工模拟,一、模拟酶的概念 所谓人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。,二、模拟酶的分类,主-客体酶模型 主客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主

11、体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。 这一类模拟酶中最具代表性的是环糊精 。 它是一种优良的模拟酶，可提供一个疏水的结合部位并能与一些无机和有机分子形成包结络合物，以此影响和催化一些反应。,-环糊精的分子结构,2. 胶束模拟酶 胶束在水溶液中提供了疏水微环境（类似于酶的结合部位），可以对底物束缚，如果将催化基团如咪唑基、巯基、羟基和一些辅酶共价或非共价地连接或吸附在胶束上，就有可能提供“活性中心”部位，使胶束成为具有酶活力或部分酶活力的胶束模拟酶。,3. 肽酶 肽酶就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽，这是多肽合成的一大热点。,4. 半合成酶 它是以天然酶为母体，用化学方

12、法或基因工程方法引进适当的活性部位或催化基团，从而形成一种新的人工酶。 半合成酶可分为两种类型： 一类是以具有酶活性的蛋白为母体，在其活性中心引入催化功能部分； 另一类是利用天然蛋白进行构象修饰，创造新的酶活性中心。,5. 印迹酶 如果以一种分子充当模板，其周围用聚 合物交联，当模板分子除去后，此聚合物就留下了与此分子相匹配的空穴。如果构建合适，这种聚合物就像“锁”一样对“钥匙”具有选择性识别作用，这种技术被称为分子印迹。,分子印迹示意图,通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，更重要的是利用此技术可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。,

13、第五节 酶的化学修饰,酶化学修饰的概念 通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。这种应用化学方法对酶分子施行种种“手术”的技术称为酶分子的化学修饰。,2. 酶的化学修饰的目的和意义 人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。,概括起来主要有： 1.提高生物活性（包括某些在修饰后对效应物反应性能的改变）。 2. 增强在不良环境（非生理条件）中的稳定性。 3. 针对异体反应，降低生物识别能力。,化学修饰的措施 修饰酶的功能基团 酶分子内或分子间进行交联 修饰酶的辅因子 酶

14、与高分子化和物相结合,修饰酶的特性 热稳定性提高 抗各类失活因子能力提高 抗原性消除 体内半衰期延长 最适改变 酶学性质变化 对组织分布能力改变,酶的化学修饰的前景 化学修饰可以改变天然酶各种活 性,扩大酶的应用范围。化学修饰 法是改造酶分子的有效方法，而 且已有了一定的规律性和普遍性， 具有广泛的应用前景。,第六节酶工程研究的进展,一、有机相的酶反应 有机相酶反应是指酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反应。,有机相中酶催化反应的优点：,增加疏水性底物或产物的溶解度。 热力学平衡向合成方向移动，如酯合成、肽合成等。 可抑制有水参与的副反应，如酸酐的水解等。 酶不溶于有机介质，易于回收再利用。 容易从低沸点的溶剂中分离纯化产物。 酶的热稳定性提高，pH的适应性扩大。 无微生物污染。 能测定某些在水介质中不能测定的常数。 固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面。,二、核酶和脱氧核酶 具有催化活性的RNA,称为核酶。 具有催化活性的DNA,称为脱氧核酶。