生化实验四--乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白.ppt

1、乙酸纤维素薄膜电泳分离血清蛋白,药学1102班 三组,一 实验目的,1.学习区带电泳的原理 2.掌握乙酸纤维素膜电泳操作技术,二 实验原理,电泳：带有电荷的颗粒在电场中向与其电性相反的电极移动 蛋白质分子是两性电解质，由于解离基团的差异，不同的蛋白质具有不同的等电点,血清中含有数种蛋白质，在pH8.6的缓冲溶液中电泳，在同一电泳中涌动的方向和速度不同，从而使蛋白质混合样品得以分离 电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，可得到背景无色的各蛋白质电泳图谱。 各蛋白质含量可用光密度计直接测定，或用洗脱法进行比色测定,三 器材与试剂,器材 电泳仪、电泳槽、微量注射器或微量吸管、载玻片、滤纸、竹镊子、培养皿

2、、纱布、可见光分光光度计、乙酸纤维素薄膜、血清。,巴尔妥-巴尔妥钠缓冲液 染色剂 （取氨基黑10B 0.5g，加蒸馏水40ml，甲醇50ml和冰乙酸10ml混匀，可重复使用。） 漂洗液 （乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml混匀。） 透明液 （无水乙醇70ml，冰乙酸30ml混匀。） 浸出液 （0.4mol/L的NaOH溶液）,试 剂,四、实验步骤,将乙酸纤 维素薄膜切成 8cm2cm 条状,把薄膜 浸入PH8.6的 巴比妥 巴比妥钠 缓冲液,完全浸透后， 竹镊子取出 薄膜，,无光泽面朝上， 平铺在滤纸上 用另外一张滤纸 轻压吸缓冲液,吸取23l血清 涂在载玻片一端 截面处,距膜一端 1

3、.5cm 处相接触,样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片,把薄膜 浸入PH8.6的 巴比妥 巴比妥钠 缓冲液,完全浸透后， 竹镊子取出 薄膜，,无光泽面朝上， 平铺在滤纸上 用另外一张滤纸 轻压吸缓冲液,吸取23l血清 涂在载玻片一端 截面处,距膜一端 1.5cm 处相接触,样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片,样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片,样品呈直线状涂于薄膜上 血清渗入薄膜内 移去玻片,乙酸纤维素薄膜点样图,薄膜点样面向上 点样端置于阴极端 平贴在 电泳槽支架上,薄膜两端分别 用四层纱布 建盐桥,纱布盐桥浸入 两极电泳缓冲液中 盖上盖子， 使薄膜

4、充分浸润,调节电压电流 待样品泳动 距点样处4.55cm 时关闭电源,薄膜浸于染色液中 染色510min,用漂洗液漂洗45次 每次约5min 背景无色时 浸入蒸馏水中,漂洗后吹干 浸入透明液中 约20min,取出， 平贴于干净 玻璃板 干燥,得背景透明的 电泳图谱， 观察,7、如要对血清各蛋白进行定量测定可采用下列方法。 （1）洗脱法 取试管5支，标号，分别加入0.4mol/L的NaOH溶液4.0ml。 将实验步骤四漂洗干净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别放入各试管中，振荡约10min。 待色泽完全浸出后，以0.4mol/L的NaOH溶液为对照，与620nm处测得各管的吸光度，分别记

5、为A清、A1、A2、A、A。,各种血清蛋白的相对百分含量为： 个别蛋白质的A620值 所有蛋白质A620值总和 （2）光密度法 将步骤5中透明处理的薄膜用光密度计直接测定（数值参考书p29）,注意事项,1、乙酸纤维素薄膜一定要完全浸透，如有任何斑点、污染或划痕，均不能使用。浸泡后的乙酸纤维素薄膜取出后用滤纸吸去其表面的缓冲液即可，不可吸得过干。 2、搭在阴阳两极上的薄膜应完全和盐桥接触。多个膜条进行电泳时，相邻膜之间应留有间隙，不能相互接触。,3、使用血清点样器直接在薄膜上进行血清点样，同样可以获得很好的效果。 4、电泳时间的长短，应以血清各组分最佳分离效果为标准，一般是在以移动最快的血清清蛋白距阳极约1cm处停止电泳。,电泳仪和电泳槽,使用方法 1.用导线将电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端联接，不要将正负极接反。 2.电泳仪电源开关调至关的位置，电压旋钮转到最小，根据工作需要选择稳压稳流方式及电压电流范围。 3.接通电源，缓缓旋转电压调节钮直到达到的所需电压为止，设定电泳终止时间，此时电泳即开始进行。 4.工作完毕后，应将各旋钮、开关旋至零位或关闭状态，并拔出电泳插头。,注意事项,1. 禁接触电极、电泳物及其它可能带电部分，不能到电泳槽内取放东西，如需要应先断电，以免触电。 2. 不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。