生化技术Biochemical Technique上海第二医科大学检验系临床....ppt

1、医学资料,1,生化技术Biochemical Technique上海第二医科大学检验系临床生化与生化技术检验,医学资料,2,一.什么是生化技术？ 生化技术是研究生物体的化学组成、结构、功能以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的实验方法。,医学资料,3,内容： 生物大分子的一般制备 分子生物学的基本操作,医学资料,4,分离纯化检测生物大分子 电泳 Electrophoresis 层析 Chromatography 离心 Centrifugation 检测 光谱分析法,分离,医学资料,5,二.生物大分子的一般制备法 体液： 直接分离生物样品 组织细胞：先破细胞分离 检测,医学资料,6,生物大

2、分子制备的四个阶段,选择材料和预处理 组织细胞的破碎及细胞器的分离 生物大分子的分离纯化 浓缩、干燥和保存,医学资料,7,（一）材料选择和预处理：微生物 植物 动物,医学资料,8,（二）组织细胞破碎的方法：1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer),医学资料,9,研钵（加净砂或玻璃粉）,医学资料,10,高速组织捣碎器,医学资料,11,超声波,医学资料,12,渗透压法 反复冻融法,医学资料,13,2.化学方法 有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层）3.酶法 自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的 -1，4-糖苷键）,医学资料,14,（三）生物大分子的分离、纯化 以蛋白质为例

3、【提取】相似相溶1.水溶液的提取 中性盐溶液提取： 缓冲液提取：2.有机溶剂提取,医学资料,15,【分离纯化】1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法：（1）盐溶与盐析 （Salting in & Salting out) 蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为“盐溶”。,医学资料,16,当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为“盐析”。,医学资料,17,盐析作用的产生由于盐离子同水分子发生水合作用， 造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子， 减弱了蛋白质的水合程度。蛋白质表面的电荷被盐

4、溶液中对应的 离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋 白质等的溶解度下降，蛋白分子相互 聚集而沉淀析出。,医学资料,18,中性盐的选择 硫酸铵 (NH4)2SO4 硫酸钠 Na2SO4,医学资料,19,例：分离球蛋白和白蛋白 血清1ml 1ml PBS充分混合。 逐渐加入饱和(NH4)2SO4 溶液至50%，边加边搅拌。 离心 上清 沉淀（球蛋白）,医学资料,20,（2）等电点沉淀法（溶解度最小） PI MW Alb 4.86 66 000 1 5.02 130 000 2 5.02 200 000 5.12 1 300 000 6.87.3 1 500 000,医学资料,21,（3）低温有机溶剂沉

5、淀法甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低 并析出。 脱水、介电常数小分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在 低温下进行。 （4）聚乙二醇沉淀法,医学资料,22,2.根据蛋白质分子大小不同的 分离方法：,医学资料,23,（1）透析和超滤 （Dialysis & Ultrafiltration)透析： 利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。超滤（反向渗透） 利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。,医学资料,24,（2）凝胶层析法（Gel Chromatography) 利用各种物质分子大小不同，

6、在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。（3）SDS-PAGE,医学资料,25,3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法： 醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳离子交换层析法,医学资料,26,醋酸纤维素薄膜电泳 血清蛋白质的分离 分子量 pI白蛋白 66000 4.861球蛋白 130000 5.022球蛋白 200000 5.02球蛋白 1300000 5.12球蛋白 1500000 6.8-7.3,医学资料,27,+,白蛋白,1,2,加样,医学资料,28,+,医学资料,29,清蛋白Alb,2,1,+,医学资料,30,医学资料,31,琼脂糖凝胶电

7、泳,从海藻中提取出来的一种线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。,医学资料,32,分离血浆脂蛋白 脂质 蛋白质 直径 CM 98% 2% 100 VLDL 90% 10% 75 LDL 70% 30% 20 HDL 50% 50% 10,医学资料,33,加样槽 前 ,CM LDL VLDL HDL,+,医学资料,34,+,医学资料,35,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（1）丙烯酰胺结构式,医学资料,36,（2）亚甲双丙烯酰胺,医学资料,37,医学资料,38,等电聚焦电泳,载体两性电解质,医学资料,39,医学资料,40,离子交换层析法,医学资料,41,医学资料,42,4.根据

8、配体特异性的分离法： 亲和层析,医学资料,43,5.根据被分离分子的密度 -离心技术,医学资料,44,【鉴定】检测-光谱分析法 RNA & DNA 260nm 蛋白质 280nm,医学资料,45,（四）浓缩、干燥、保存 样品的浓缩 1、减压加温蒸发浓缩 2、空气流动蒸发浓缩 3、冰冻法 4、吸收法 5、超滤,医学资料,46,干燥 真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。 冷冻干燥在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。,医学资料,47,保存 1、干燥制品的贮存 2、液态贮存 样品不能太稀 一般需加入防腐剂、稳定剂 低温贮存,医学资料,48,三、 分

9、子生物学技术,重组DNA技术的基本步骤1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离,DNA的提取：组织、细胞、质粒RNA的提取：组织、细胞PCR技术：常规PCR、RT-PCR限制性内切酶Western blot,医学资料,49,四.生化技术的特点： 1.条件温和 2.实验条件与机体内环境尽 量符合,医学资料,50,五.生化技术的应用：1.工业、农业研究、生产2.生化研究3.临床应用、诊断,医学资料,51,六.发展趋势：超微量高效自动化快速综合联用 比色- 计算机,医学资料,52,小结： 1、掌握生物大分子的