酶的分子修饰.ppt

1、酶的分子修饰,第四组： 李俏 1009034220 郭超 1009034221 高雪松 1009034222 周金月 1009034223 王洁 1009034224 刘旭东 1009034225,酶分子的侧链基团修饰-分子内交联修饰,分子内交联修饰：通过含有双功能集团的化合物，在酶蛋白分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交联，从而提高酶的稳定新的修饰方法。 通过分子内交联修饰，可以使酶分子的空间构象更为稳定，从而提高酶分子的稳定性。,双功能基团化合物根据其功能基团的特点可以分为同型双功能基团化合物和异型双功能基团化合物两大类。,同型双功能基团化合物的两端具有相同的功能基团。例，乙二胺，戊

2、二醛等。 异型双功能基团化合物的两端的功能基团基本不想同，可以与酶分子上不同的侧链基团反应，如一端与酶分子的氨基作用，另一端与酶分子的巯基或羧基作用等。 交联剂的种类很多，不同的交联剂具有不同的分子长度，其交联基团、交联速度和交联效果也有所差别，可以通过试验找出适宜的交联剂进行分子内交联修饰。,值得注意的是分子内交联是在同一个酶分子内进行的交联反应，如果双功能基团试剂的两个功能基团分别在两个酶分子之间或者在酶分子与其他分子之间进行交联，则可以使酶的水溶性降低，成为不溶于水的固定化酶，这就叫做交联固定化。,酶分子的侧链基团修饰-大分子结合修饰,一、定义：,采用水分子与酶蛋白的侧链基团的共价结合，

3、使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰。（Macromolecules combine modification） 通常使用的水溶性大分子修饰剂：右旋糖酐，聚乙二醇，蔗糖聚合物等。该大分子经活化后与酶分子共价结合，对酶分子进行修饰。,大分子修饰(共价)的过程,选择修饰剂,活化,修饰,分离,例 右旋糖酐修饰酶分子的过程：,在众多的大分子修饰剂中，相对分子量为100010000的PEG应用最为广泛。 PEG 既可溶于水，又可溶于多种有机溶剂 微毒或无毒 免疫原性低 生物相容性好，已通过 FDA 认证 分子量范围很宽，从几百到数十万，选择余地大 末端有两个能被活化

4、的 OH 基团 为了获得单功能的PEG，将其中一个羟基转化为烷氧基，即单甲氧基聚乙二醇（MPEG）,MPEG可以采用不同的试剂进行活化，制成可以在不同条件下对酶分子上不同基团进行修饰的聚乙二醇衍生物。用于酶分子修饰的主要聚乙二醇衍生物有：,聚乙二醇均三嗪衍生物 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 聚乙二醇马来酸酐衍生物 聚乙二醇胺类衍生物,酶分子的大分子结合修饰的作用：, 提高酶的催化效率 根本原因：改变了酶的空间构象，有可能促使酶活性中心与底物更容易结合 酶的催化功能是由其空间结构决定的 例1：1 分子核糖核酸酶与 6.5 分子右旋糖酐共价结合，活力提高到原有的 2.25 倍 例2：1 分子胰凝乳蛋白

5、酶与 11 分子右旋糖酐共价结合，酶的催化效率提高到原酶的 5.1 倍,位阻效应,大分子修饰的作用 增强酶的稳定性 水溶性大分子与酶结合，在酶分子外层形成保护层，可以保护酶的空间构象 不溶性大分子与酶结合，形成固定化 酶，也提高酶的稳定性 稳定性的表征 半衰期 酶的半衰期：酶活力降低到原来活力一半时所经过的时间,大分子修饰的作用 降低或消除抗原性 酶非经口（如注射）进入人体后，会成为一种抗原，刺激体内产生抗体；当这种酶再次注射进体内时，抗体就会与作为抗原的酶特异地结合，使酶失去催化功能 经过大分子修饰，酶蛋白的空间结构发生改变，致使酶蛋白与抗体之间不再发生特异性识别，从而降低了酶蛋白与体内抗体

6、的结合几率 例如：L-天冬酰胺酶 EC 3.5.1.1 经 PEG 修饰后抗原性显著降低，已经在 1994 年被 FDA 批准用于治疗急性淋巴性白血病,酶分子的侧链基团修饰-亲和修饰,酶的亲和修饰Affinity modification，酶的专一性修饰,试剂作用于特定部位的某一基团，而不与这一部位之外的同类基团反应 用于酶化学修饰的试剂，即使对某一基团反应是专一的，也仍然有多个同类残基与之反应，因此对某个特定残基的选择性修饰比较困难，为了解决此问题，开发了亲和标记试剂 这类修饰剂也称为位点专一性抑制剂，一般具有与底物相似的结构，对酶活性部位具有高度的亲和性，可专一性标记于酶的活性中心上，使酶

7、不可逆失活，因此也称专一性不可逆抑制剂,与酶分子的某一特定部分（通常是酶的活性部位）有特异的亲和力，可以与这个特殊部位结合而进行酶分子修饰的试剂称为亲和标记试剂，通常采用酶的底物类似物作为亲和标记试剂。,亲和标记试剂的特点 在使酶不可逆失活以前，要与酶形成可逆复合物 亲和试剂的修饰程度是有限的 竞争性类似物的存在会降低修饰反应速率 亲和试剂体积不能太大，否则造成较大的空间位阻 修饰产物应当稳定，应便于表征和定量,分类,KS 型（竞争性标记试剂） 根据底物的结构设计的，具有与底物结构相似的结合基团，同时还具有能与酶活性部位氨基酸侧链反应的活性基团 特点 底物、竞争性抑制剂及其他结构类似物对修饰具

8、有保护作用 修饰反应是定量定点进行的 Kcat 型（自杀性标记试剂） 根据酶催化过程设计，专一性很高 具有酶的底物性质，还有一个潜在的反应基团在酶催化下活化，与酶活性部位氨基酸侧链发生反应，不可逆地结合,金属离子置换修饰Metal ion substitute modification,通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法，简称金属离子置换法。,有些含有金属离子的酶，该金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的催化功能起重要作用。如：过氧化氢酶中的Fe2+ 用于修饰酶分子的金属离子通常是二价金属离子。如：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Fe

9、2+等。,金属离子,去除酶分子中的金属离子或对其中的金属离子进行置 换会给酶造成怎么样的影响？,若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果从新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。 若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现不同的特性。,金属离子对酶活性的影响可分为两类：激活剂和抑制剂。,有激活作用的金属离子主要有K+，Na+，Ca2+及Mg2+等。它们对于许多激酶和合成栈具有激活作用。例如Mg2+是多种磷酸化激酶的激活剂。 具有抑制作用的金属离子主要是重金属离子，例如Hg2+，Pb2+，g+和As3+等。汞和砷化合物能够与巯基作用，抑制酶活性中心含有关胱氨酸

10、的酶的活性。砷化物还可以与辅酶硫辛酸作用： 砷化物对丙酮酸氧化酶系的抑制作用主要是破坏了硫辛酸辅酶功能。,离子置换修饰过程,分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化除去杂质，获得具有一定纯度的酶液 除去原有的金属离子：加入金属螯合剂（EDTA等）与酶分子中的金属离子形成螯合物，通过透析，超滤，分子筛层析等方法，将螯合物除去，此时的酶是无活性状态。 加入置换离子：在去离子的酶液中加入另一种金属离子，与酶蛋白结合，除去多余的置换离子，完成了修饰过程。,金属离子置换修饰的方法 酶的提纯 除去原有金属离子 加入金属螯合剂，如 EDTA 等，让酶分子中的金属离子与 EDTA形成螯合物 透析、超滤或层析除去螯合物 加入置换的离子 加入含另一种金属离子的溶液，酶蛋白与其结合 用透析或层析等方法除去未结合的离子,操作：,酶液,加入EDTA,酶失活,去除 M2+-EDTA,加入新金属 离子修饰,经过金属离子置换后的