碱性磷酸酶染色(NAP).ppt

1、碱性磷酸酶染色（NAP）,目的 掌握卡氏偶氮偶联法测定中性粒细胞碱性磷酸酶染色的原理、 方法、注意事项和临床意义。 原理 中性粒细胞胞质中的碱性磷酸酶在pH9.6的碱性条件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者与重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀定位于胞质中的酶活性处。重氮盐有多种，常用的有坚牢蓝RR、坚牢蓝BB、坚牢紫酱等。,新鲜干燥的涂片用冷10%甲醛甲醇固定液固定30s，流水轻轻冲洗3060s，待干。 把涂片浸入基质孵育液中，在室温(冬季放水浴箱)下温育1015min。 流水冲洗1 2min，加苏木素染色液中复染58min，流水冲洗，待干，镜检。 结果判断胞质中出现紫黑色或棕红色颗粒为阳性。判断标

2、准如下： 0分：胞质中无阳性染色颗粒。 1分：胞质中含少量颗粒或呈弥漫浅色。 2分：胞质中含中等量的颗粒或呈弥漫着色。 3分：胞质中含较多颗粒或弥漫较深色。 4分：胞质中充满粗大颗粒或弥漫深色。 5 计算阳性率和积分值。,方法步骤,磷酸萘酚盐和重氮试剂品种繁多，应根据基质选择相适应的重氮盐，坚牢蓝等重氮盐的质量好坏是本法成败的关键。 基质孵育液必须临用前新鲜配制，先应将血膜固定干燥后，才开始配制基质液。 若无2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇，可用巴比妥缓冲液(pH9.2)或0.2mol/L Tris缓冲液(pH9.2)代替。,注意事项,临床上主要用于鉴别： 1.慢性粒细胞白血病与类白血病反应

3、： 慢性粒细胞白血病(无继发性感染者)时，NAP积分一般明显下降，积分常13分，甚至为零分；类白血病反应时则显著增高，积分常200分。 2.阵发性睡眠性血红蛋白尿症与再生障碍性贫血： 阵发性睡眠性血红蛋白尿症常降低；再生障碍性贫血常增高，病情好转时，NAP积分则可逐渐下降。 3.急性白血病的细胞类型：ALL增高，AML下降。,临床意义,铁染色（Iron stain）,目的 掌握骨髓铁染色的原理、方法、注意事项及临床意义。 原理 骨髓小粒中的含铁血黄素称细胞外铁，其所含的三价铁经稀盐酸处理后而游离，并能与酸性亚铁氰化钾溶液发生普鲁士蓝反应，生成蓝色亚铁氰化铁沉淀，定位于含铁的部位。细胞内铁也可用

4、此法显示，根据反应的强弱可了解骨髓中铁的含量。,干燥涂片用甲醇固定10min，待干。 玻片上滴满酸性亚铁氰化钾，37染色30min。 用蒸馏水冲洗后用核固红染液复染1015min。 流水冲洗，待干，镜检。 结果判断 (1) 幼红细胞核呈鲜红色，胞质呈淡黄红色，铁粒呈蓝绿色。 (2) 细胞外铁 用低倍镜观察涂片，特别是涂片尾部和髓粒附近，注 意翠蓝色颗粒的存在，可分五级标准。 (3) 细胞内铁 用油镜计数100个中、晚幼红细胞，记录胞质中含有蓝色铁颗粒的细胞(铁粒幼细胞)的百分率。根据细胞内铁颗粒的数目、大小、染色深浅和颗粒分布的情况，将铁粒幼细胞分为四型。,方法步骤,细胞外铁的划分标准: (-

5、)：无颗粒。 (+)：有少数铁颗粒或偶见铁小珠(颗粒体积大于嗜酸性粒细胞的颗粒者 称为铁小珠)。 (+)：有较多的铁颗粒或小珠。 (+)：有很多的铁颗粒、小珠和少数小块状。 (+)：有极多铁颗粒、小珠，并有很多的小块，密集成堆。,铁粒幼细胞划分： 型：幼红细胞内含12个小铁颗粒。 型：幼红细胞内含35个小铁颗粒。 型：幼红细胞内含610个小铁颗粒，或1-4个大铁颗粒。 型：幼红细胞内含10个以上小铁颗粒，或5个以上大铁颗粒。 环形铁粒幼细胞：是指幼红细胞含铁粒6个，绕核2/3以上者。,玻片需经去铁处理 将新玻片用清洁液浸泡24h，取出后反复水洗浸入95%酒精中24h，晾干，再浸泡在5%盐酸中24h，用双蒸水反复浸洗玻片，取出烤干后备用。 骨髓取材要满意，外铁一定要有骨髓碎块或颗粒，取材不佳时，往往影响结果。 酸性亚铁氰化钾溶液须新鲜配制。,注意事项,鉴别缺铁性贫血和非缺铁性贫血：IDA时骨髓细胞外铁显著减少或消失，铁粒幼红细胞明显减少，所见铁粒细小色浅，且以型为主，型极少见，型以上不见。经铁剂治疗后细胞外铁及内铁可迅速增多，此检查是诊断IDA及指导铁剂治疗的一种辅助方法；非IDA，如HA、MA、AA等病人的细胞外铁通常增高，内铁亦增高，以型、型为主，可以见到型，罕见型。因此，有助于鉴别ID