细胞工程(课堂PPT)

1、1,细 胞 工 程CELL ENGINEERING,改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程,刘广发,2,细胞工程主要内容（1）,细胞工程的基础知识与基本技术； 植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术；,3,细胞工程主要内容（2）,动物细胞与组织培养 动物细胞融合 细胞重构与动物克隆 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 染色体转移与基因转移 人类干细胞研究 原核细胞的原生质体融合 真菌细胞的原生质体融合,4,参考文献,自编. 细胞工程讲义 罗立新等. 细胞工程. 华南理工大学出版社，2003 李志勇编著. 细胞工

2、程. 科学出版社，2003,5,探究式自主学习计划,自愿组成学习小组，3人左右，选出组长； 每组选一个主题，时间约10 min； 各组需准备PowerPoint; 各组最高可得8分； 其他同学可提问、补充或更正； 教师讲评和讨论；,6,探究式自主学习安排（已选）,7,探究式自主学习安排（2）,8,细胞工程的三个层次,细胞水平：细胞培养, 细胞融合，整株培养； 细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞器； 基因水平：基因转化；,9,开展细胞工程的意义,研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点； 有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品种的步伐； 可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物；

3、 有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产； 可获得脱毒植物；,10,第一章 细胞工程发展简史,一. 植物细胞工程 1902 德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具全能性； 1904 德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成植株； 1922 Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根； 1930-34 李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长； 1934 美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；,11,植物细胞工程,1935-36 中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长； 1937 美国White发现Vit B促进离体根生长，指出IAA能调控

4、生长； 1937 美国Michel首创用0.5M NaNO3融合两个植物细胞原生质体； 1941 Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚； ？ Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；,12,植物细胞工程,1956 Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍； 1958 Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株； 1953 Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养； 1960 英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体； 1964 印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织； 1968

5、Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；,13,植物细胞工程,1972 Carlson用NaNO3成功融合不同烟草的原生质体； 1977 Kao（高国南）首创PEG- 高钙高pH值细胞融合法； 1978 Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物； 1985 Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、日本和法国相继开展 人工种子研制；,14,二. 动物细胞工程,1885 Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天； 1903 Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月； 1907 美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长出轴突； 1914 Tomson创立能在培养基中维持器官小块的

6、方法； ？ Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限生长；,15,动物细胞工程,1940 Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系； 1951 Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系； 1958 冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合； 1960s 童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；,16,动物细胞工程,1960 Barski成功进行小鼠细胞融合实验； 1965 Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞； 1967 Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失； 1975 Kohler 吲哚丁酸（IBA）,常用

7、15 mg/L； 2，4-D（ 2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-510-7 mol/L; 萘乙酸（NAA），常用1.0 mg/L；,34,细胞分裂素类激素,激动素（KT） 6-苄氨基嘌呤（6-BA） 玉米素,先加少量碱液预溶,35,继代增殖阶段,移植扩增； 分割继代；,36,光照培养室,37,生根长芽阶段,生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用； 外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；,38,长芽生根阶段,39,移栽成活阶段,保湿是关键； 避免强光直射； 温度适宜；,40

8、,植物组培的优缺点,优点： A B C D 缺点： A B C,41,手指玫瑰,42,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,本方法的历史、现状 1956年，Routier 1981年，Fujita等经培养生产出“紫草素”； 1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L； 目前世界最大的细胞培养罐达20 t；,43,红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物,44,细胞培养和原植物的天然产物量的比较,产 量 物 种 天然产物 细胞培养 原 植 物 橘叶鸡眼藤 蒽醌 900微克/克干重 110微克/克干重 决 明 蒽醌 鲜重的0.334% 种子干重的0.21% 长 春 花 蛇根碱 干重的

9、1.3% 干重的0.26 % 三角叶薯蓣 薯蓣皂苷 26mg/克干重 20mg/克干块根 人 参 人参皂角苷 鲜重的0.38% 鲜重的0.33.3% 烟 草 烟碱 干重的3.4% 干重的25% 烟 草 泛醌 0.5mg/克干重 16mg/克干叶 大 红 罂 粟 蒂巴因 130mg/克干重 140mg/克干叶,45,从植物培养细胞中获得的各类物质,氨基酸 核酸 蛋白质 碳水化合物 脂类 维生素 有机酸 抗白血病药 抗肿瘤药 抗病毒药 抗微生物药 酶抑制剂 色素 香料 甜味剂 鸦片 杀虫剂 激素 强心苷 核苷酸 橡胶 阿司匹林 奎宁 可卡因,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,46,培养植物细胞

10、制造疫苗,2006年2月，美国DowAgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗； 将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中生产疫苗，以激活人体的免疫能力。在制造过程中完全不含有任何动物成份。,47,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,悬浮培养 1.成批培养（封闭式培养） 优点：易于操作； 次生代谢物含量高； 缺点：效率低； 2.半连续和连续培养,48,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,固定化细胞培养 次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性； 细胞固定化有利于组织化的形成； 细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成化学物质

11、和各种物理因素的梯度，这是高产次生代谢物的关键； 细胞固定化有利于对外环境参数进行调控； 细胞固定化有利于回收次生代谢物；,49,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,平床培养系统 优点：制作简单； 能生产较多次生代谢物； 缺点：占地面积大； 分化区比例较小； 02供应受限；,50,包埋法固定细胞,将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包埋于半透性聚合物的超滤膜内，它又分为凝胶包埋法和微胶囊法。 凝胶包埋法固定化（gel immobilization)海藻酸盐（alginate) -角叉胶（-carrageenan) 琼脂糖（agarose) 琼脂（agar) 聚丙烯酰胺（polyacrylami

12、de) 壳聚糖（chitosan) 白明胶（gelatin),51,微胶囊法,微胶囊法是利用天然的或合成的高分子材料作为微囊壁材，包裹成微小球囊，培养基成分和代谢产物等小分子物质可以通过，细胞不能通过，使囊内成为一个微小环境。,52,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,立柱培养系统 1.细胞固定化 琼脂固定细胞,53,褐藻酸钙固定细胞 无菌大量培养植物细胞 等量混合 注入尼龙网 配制4%褐藻酸钠，灭菌 氯化钙溶液（2%）浸浴 褐藻酸钙固定的细胞团,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,54,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,立柱培养系统 优点：占地面积小 次生代谢物产量高 缺点：制作较复

13、杂 O2供应受限,55,立柱培养系统操作要素： 取静止期细胞，并使细胞达到一定密度； 控制营养液的成分（包括激素）、浓度及O2供应； 某些种的细胞培养需光照； 尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞内释出的植物（品种）；,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,56,提高次生代谢物产量的途径 生物种性： 1.选择高产的品系或细胞系； 目测法，化学分析法，外因选择法； 2.诱变筛选高产细胞系： 化学法，物理法； 3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系；,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,57,提高次生代谢物产量的途径 培养条件: 1.培养基： A 碳源：常用蔗糖，但应因种摸索； B 氮源：

14、常用NO3-和NH4+，（或单用或兼用）； C 生长调节剂：生长素及细胞分类素。两者 的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生 产具极大影响； D 供给目的产物的直接或近直接前体物质；,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,58,提高次生代谢物产量的途径 培养条件: 2.物理因子： A 光质和光量（适量光照）； B 温度：2530； C 通气：底部通气好； D pH值：56,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,59,第三节 植物原生质体制备与融合,原生质体（protoplast):去除全部细胞壁的细胞； 亚原生质体（subprotoplast):只含有部分原生质的原生质体（有核或无核）； 微原生

15、质体（miniprotoplast):经细胞松弛素B处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原生质体； 原生质球（球状体，spheroplast):残存少量细胞壁的原生质体；,几个名词：,60,植物原生质体研究的意义,有利于进行远缘杂交； 有利于引入生物大分子、细胞器等； 有利于进行细胞操作（核、叶绿体等）；,61,植物原生质体的制备(1),机械法： 高渗处理 植物（外植体，愈伤组织，液培细胞） 质壁分离 机械切割 原生质体（亚原生质体） 缺点：难，少，分生组织不宜；,62,酶解法 1.酶的购置与纯化 市售的纤维素酶一般都是复合酶，含： 纤维素酶C1； 纤维素酶Cx； 纤维二糖酶； 果胶酶； 磷

16、脂酶； 核酸酶； 过氧化物酶； 酚类； 此外，还有蜗牛酶；,植物原生质体的制备(2),最好应纯化,63,酶解法 2.取材：干净，高活性 A 幼嫩的根、茎、叶； B 悬浮培养的细胞和体细胞胚； 无需灭菌，最好同步化； C 花粉母细胞和四分体； 分生能力强，应使用蜗牛酶；,植物原生质体的制备(3),64,外植体除菌： 外植体 肥皂水洗 清水洗 酒精 （75%，10s） 次氯酸钠（3%，15min） 无菌水洗34次 无菌滤纸吸干,植物原生质体的制备(4),65,外植体酶解 除菌后叶片 撕去下表皮 切块放入反应液 2530 不时轻摇 反应液转绿 24 h,植物原生质体的制备(5),66,外植体酶解 缓

17、冲液：pH值 5.55.8 渗透压稳定剂：糖、甘露醇、山梨醇等 膜保护剂：钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖硫酸钾（0.3%） 表面活性剂：Tween 80 适当时间 适当温度,植物原生质体的制备(6),67,原生质体分离 过滤法 离心法（低速） 漂浮法（不同比重）,植物原生质体的制备(7),68,原生质体洗涤 以新的渗透压稳定剂或培养液轻轻洗涤24次;,植物原生质体的制备(8),69,原生质体鉴定 1.直接镜检： 球形，低渗破裂，荧光增白剂(UV下细胞壁显绿色荧光） 2.活力测定： 双醋酸荧光素（FDA）染色法：FDA进入细胞，被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能进入死细胞； 台盼蓝染色：台盼

18、蓝不能进入活细胞； 胞质环流观察；,植物原生质体的制备(9),70,植物原生质体的培养基,无机成分: KNO3 725; CaCl22H2O 685; MgSO4 560; NH4NO3 288; K2HPO4 68; Na2EDTA 37.3; Fe2SO47H2O 27.8; H3BO4 3.0; MnSO44H2O 10.0; ZnSO47H2O 2.0; KI 0.75; Na2MoO42H2O 0.25; CoCl26H2O 0.025; CuSO45H2O 0.025 糖类： (mg/L) 葡萄糖 68000； 蔗 糖 250； 果 糖 250； 核 糖 250； 木糖 250；

19、甘露糖 250； 甘露醇 250； 鼠李糖 250； 山梨醇 250； 纤维二糖 250； 维生素： (mg/L) 维生素C 2.0； 维生素B1 1.0；维生素B6 1.0；氢化胆碱 1.0；对氨基苯甲酸 0.02； 叶酸 0.4； 生物素 0.01； 维生素A 0.01； 维生素D3 0.01；维生素B12 0.01； 生长调节物： 酪蛋白 250；肌醇 100；椰子汁 20ml； NAA 1.0； 6BA 0.5； 2,4-D 0.2； 有机酸： 柠檬酸 40；苹果酸 40；反丁烯二酸 20；丙酮酸钠 20；,V-KM培养基(mg/L),71,植物原生质体再生培养方法（1）,固体平皿培养

20、法 原生质体悬液2ml 小培养皿 MS培养基配制的1.2% agar 2ml （2528， 置大皿内（预加湿滤纸） 腊带封口 培养 100300lux，12hd-1) 分化培养基 愈伤组织 成苗,摇匀 冷却,72,固体平皿培养法 优点：便于定点观察 原生质体不易破裂 缺点：通气较差 原生质体与琼脂混合不易掌握 原生质体过于分散,植物原生质体再生培养方法（1）,73,液体培养法 原生质体置液体培养基中培养，不时轻摇，能较快生长。细胞团形成后应移到固体培养基中才能继续生长或诱导分化成苗。 缺点：原生质体易受损 通气较差 操作较麻烦,植物原生质体再生培养方法（2）,74,液体浅层培养法（液-固法）

21、营养琼脂培养基（0.6%） 小皿凝固 放置无菌滤纸 注入3mL原生质体悬浮液 放大皿内（垫湿滤纸） 封口 保温，光照 （或不光照） 轻摇 愈伤组织 分化培 养基 成苗,植物原生质体再生培养方法（3）,75,液体浅层培养法（液-固法） 优点：通气好 营养均匀 生长较快 缺点：需定期添加培养基 不易更换培养基,植物原生质体再生培养方法（3）,76,小块液培法 原生质体悬浮液 琼脂糖（0.8%） 切小块 置液体培养基中 80100rpm， 2528 愈伤组织 移放分化培养基 成苗,植物原生质体再生培养方法（4）,混匀 倒平皿凝固,77,小块液培法 优点： 缺点：,植物原生质体再生培养方法（4）,78

22、,固体活性炭培养基 琼脂培养基+1%活性炭 原生质体悬浮液 平皿培养 成苗,植物原生质体再生培养方法（5）,混匀 凝固,优点： 缺点：,79,混合培养（液体或固体培养基） 将两种原生质体混合培养 有何意义？,植物原生质体再生培养方法（6）,80,植物原生质体融合回顾,1909 Kuster 把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中，见质壁分离的亚原生质体，复原时观察到亚原生质体的融合； 1931 Plower用针插入原生质体，使质膜和液泡膜融合； 1937 Michels观察到同种和不同种原生质体的融合； 1960 Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体； 1970 Power用NaNO3使燕

23、麦和玉米的原生质体融合； 1971 Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株； 1972 Carlson首次经原生质体融合获得种间杂种烟草； 1973 Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合； 1974 Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合； 1977 Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合； 1978 Melchers获得属间杂种（番茄 马铃薯）； 1979 Senda提出电激法融合原生质体； 1987 斯维格将电融合与微培养结合；,81,化学法诱导融合 （无菌操作） 按一定比例混合双亲原生质体悬液； 吸一份混合液于表面皿上，静置10min； 滴加3份聚乙二醇（PEG）溶液，轻轻

24、摇匀； PEG溶液组成： PEG 50%（MW=15606000) glucose 0.1mol/L CaCl2 10.5 mmol /L KH2PO4 0.7 mmol /L pH 5.5,植物原生质体融合（1）,82,植物原生质体融合（2）,化学法诱导融合(续前） 25保温1545min，不时轻摇； 滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀； 高钙高pH溶液组成： glycine 50 mmol /L CaCl2 50 mmol /L glucose 300 mmol /L pH 10.5 1015min后，再滴加1份高钙高pH溶液稀释，摇匀； 1015min后，再加12mL原生质体培养液，摇匀；

25、 用20mL原生质体培养液洗5次，间隔5min； 加0.5mL原生质体培养液，微滴培养；,83,物理法诱导融合 微电极法 两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质体表面接触，用512 A的电流刺激15毫秒，促成融合。 平行电极法 相距200 m的微电极插入原生质体溶液中，先通入交变电场，使其紧密接触成串珠状；再施以适当电脉冲，原生质体接触区发生可逆击穿而融合；,植物原生质体融合（3）,84,不对等细胞融合（灭活一方原生质体）,植物原生质体融合（4）,85,原生质体融合后的产物,亲和杂种细胞（难） 部分亲和的杂种细胞 含双方胞质及一方核 含双方胞质及一方核和少量它方染色体 （细胞周期短或继代次数少的

26、一方，染色体易保留） 3. 异核质杂种（少） 4. 嵌合植株,86,融和体的鉴别,细胞鉴别 细胞大小 色素有无 细胞核大小 荧光鉴别 植株鉴别 形态特征 染色体显带 同功酶法、过氧化物酶法 分子杂交法 RFLP法 RAPD法,87,杂种细胞筛选,显微操作法 要有：可识别标志 显微操作仪 能培养单个原生质体的培养基 遗传互补法 要有具突变标记的品种 1. 白化互补法 2. 生长互补法 3. 抗性互补法 4. 代谢互补法,88,西红柿与马铃薯杂交研究进展,1971年，Power提出设想 1978年，Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株 1983年，Shepard亦融合成功 亟待解决的问题

27、： 1. 哪些基因和条件决定果实与块茎的形成 2. 光合作用产物的运输方向与分配 3. 光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需要 1994年,Schoenmakers继续本研究 1995年，Wolters还在研究,89,第四节 单倍体植物的诱发与利用,一.单倍体植物的特点： 株矮，叶、花、果小，生活力弱； 高度不育； ？,90,二.单倍体植物的利用： 可加快培育新品种； 有利于突变体的选择与利用； ？,第四节 单倍体植物的诱发与利用（2）,91,三.诱导产生单倍体植株的途径： (一）自然发生 1.孤雌生殖 2.孤雄生殖 3.无融合生殖,第四节 单倍体植物的诱发与利用（3）,92,

28、三.诱导产生单倍体植株的途径： (二）人工诱导： 1.花药培养： 1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗 ； 1.2花药预处理 ； 1.3选择适当的培养基与培养条件： 1.3.1 只需简单培养基； 1.3.2 培养基尚需添加激素； 1.3.3 培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺；,第四节 单倍体植物的诱发与利用（4）,93,1.4 培养条件： 降低气压； 纯N2密闭处理3060min，或掺入O2 2.55.0%； 0.5mol/L甘露醇处理2天； 花药平放； 适当密植；,第四节 单倍体植物的诱发与利用（5）,94,1.5 花药单倍体植株的形成途径： 1.5.1 生殖细胞退化，由营养细胞分裂产生；（

29、常见） 1.5.2 小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞，直接分裂、分化长成；（常见） 1.5.3 营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚 的形成； 1.5.4 仅由生殖细胞分裂形成；,第四节 单倍体植物的诱发与利用（6）,95,2. 离体花粉培养 挤压法分离花粉； 自然散开法分离花粉； 3.未授粉子房或胚珠的培养 4.杂交法获单倍体植株,第四节 单倍体植物的诱发与利用（7）,96,5.单倍体植物的加倍 用秋水仙素（0.20.4%）处理2448h； 加倍方式？,第四节 单倍体植物的诱发与利用（8）,97,Section 5. Researches on Artificial Seeds人工种子的

30、研制（1）,人工种子：含有植物胚状体或芽、营养成 分、激素以及其它成分的人工胶囊； 人工种子的构成： 胚状体：由组织培养或细胞培养产生； 人工胚乳：营养物质+激素+农药+抗生素 + 除草剂等； 人工种皮：抗压，保水，透气；,98,Characters of artificial seeds： 不受环境因素制约, 一年四季进行工厂化生产； 有利于保存该种系的优良性状； 成本低，适合于机械化播种； 可添加营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。,Section 5. Researches on Artificial Seeds （2）,99,The synchronous gr

31、owth of embryoid 胚状体的同步化生长： 低温法 抑制剂法 分离法：分离胚性细胞团； 通气法：通入N2或乙烯； 渗透压法 ？,Section 5. Researches on Artificial Seeds （3）,100,Preparation for artificial endosperm 人工胚乳的制备： MS培养基 + 淀粉水解物 + 激素 +抗生素 + 农药 + 除草剂 等； Any one else？,Section 5. Researches on Artificial Seeds （4）,101,Embedment of artificial seeds 人工

32、种子的包埋（滴注法） 胚状体 褐藻酸钠（终浓4%） 混匀 合成胚乳,Section 5. Researches on Artificial Seeds（5）,还有其他方法？,1015min,CaCl2（2.02.5 %）,圆形胶囊,无菌水漂洗,捞起,Elvax4260处理干燥,圆形人工种子,102,人工种子的直径由 决定； 人工种子内含胚状体数目取决于 ； 人工种皮的厚度因 而定；,Section 5. Researches on Artificial Seeds（6）,103,人工种子的干燥： 自然干燥 人工干燥：22 2, 相对湿度70 5% 46 d ; 胚状体由玻璃状转为不透明表示发育

33、成熟。,Section 5. Researches on Artificial Seeds（7）,干燥的目的？,104,病毒对植物的危害 植物哪些部位可能没病毒或较少病毒？ 植物哪些器官或部位无维管束（或维管束不发达）？ 切割外植体时是大些还是小些比较可能获得无毒组织块？ 组织块大些还是小些比较容易获得愈伤组织？,第六节 植物脱病毒技术（1）,105,脱除不同病毒时所取的茎尖大小一样吗？ 茎尖很小，实验时应注意哪些问题？ 为什么有人喜欢用花瓣来脱病毒？ 哪些外因能被用于脱除病毒？ 通过培养愈伤组织能脱毒吗？Why？ 哪些途径可使脱毒植株不再染毒？,第六节 植物脱病毒技术（2）,106,第六节

34、植物脱病毒技术（3）,茎尖脱毒 1. 茎尖培养： 茎尖越小越没病毒，但越小越难成活,一般要超过2万个细胞，或至少310 mg茎尖。 2. 花瓣培养 3. 花药培养,107,植物脱毒检测（4）,电镜法 免疫血清法 离心 去渣 植物组织匀浆 上清液 纯化病毒 待检植物匀浆上清液 动物免疫 抗血清（抗体） 免疫检测,108,植物脱病毒进展（5）,脱毒马铃薯（青海） 染有病毒的普通马铃薯亩产约1吨，脱病毒的马铃薯亩产达4吨；全国年种马铃薯3400万公顷； 脱毒草莓 红宝石色，酸甜适口，果汁丰润，果香四溢； 脱毒唐菖蒲 长势旺盛，花色艳丽，品质提高12个等级； 脱毒水仙,109,Chapter 3. A

35、nimal Cell Engineering第三章 动物细胞工程,The main content： 动物细胞与组织培养; 动物细胞融合; 动物细胞核移植与胚胎克隆; 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体; 染色体转移与基因转移;,110,Section 1.Cultivation of Animal Cells and Tissues第一节 动物细胞与组织培养,细胞培养：细胞在体外条件下的保存和生长，在培养过程中不形成组织； 组织培养：组织在体外条件下的保存和生长，继续保持组织的结构和功能； 器官培养：器官的胚芽、整个器官或器官的一部分在体外条件下的保存和生长，可有器官的分化，并保持器官的立体结构和功

36、能；,111,细胞系 （Cell line) 原代培养物经首次传代成功后的细胞培养物，包括：有限细胞系和连续细胞系；细胞株 （Cell strain) 通过选择或克隆从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的培养物；,112,一.细胞培养,Section 1. Cultivation of animal cells and tissues 第一节 动物细胞组织培养,制备动物细胞：,培养液漂洗 切割 解离液 无菌取出目的组织 无菌组织 小组织块 细胞 移放培养瓶,抗生素漂洗,离心洗涤,113,动物细胞培养,114,Quantitative cultivation of mammal cel

37、ls 二. 大量培养哺乳动物细胞,微导管法 以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维管，搭成多层培养床。管内通空气，管外为培养液； 微载体法 葡萄糖等聚合物形成直径50500m的微球 悬浮培养液中 细胞贴附生长 微胶囊法 细胞与褐藻酸钠混合液 滴入CaCl2中 褐藻酸钙胶囊 悬浮培养,115,动物细胞培养器,116,Tissues cultivation三. 组织培养,动物表面消毒 获组织 小组织块,鸡胚心肌组织如何培养？,无菌刀切,加培养液,吸放培养瓶,静置培养（37）,组织块长大,传代,众多组织块,培养液、抗生素漂洗,解剖,117,Generation of the cultivated ce

38、ll四. 培养细胞的传代,胰酶EDTA 离心 培养细胞 贴壁细胞游离 弃上清 加新培养液 分瓶 细胞沉淀 悬浮细胞,培养,118,Non-serum cultivation五. 无血清培养,血清培养的缺点： 成分不确定，批次有差异，容易受污染，价格较昂贵； 无血清培养基的组成： 基础培养基：常用DME与F12培养基等量混合； 基质：纤粘素，血清铺展因子，胎球蛋白，多聚赖氨酸，胶原； 生长因子、维生素和激素等约30余种微量有机和无机物；,119,六.无血清培养基常用生长因子与激素,胰高血糖素 神经生长因子 胰岛素 甲状腺释放激素 前列腺素E2a 表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 前列腺素E1 生

39、长激素 黄体化激素释放激素 黄体化激素 甲状旁腺激素 转铁蛋白母羊因子 氢化考的松 Sometomedin C 无脂肪酸牛血清白蛋白 雌二醇 孕酮 促卵泡刺激因子 睾酮三碘甲状腺氨酸 亚油酸 维生素A醇 -生育酚 维生素C 腐胺 CdSO4 H2SeO3,120,Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (1),微生物污染： 细菌污染； 真菌污染； 支原体污染； 病毒污染 其它细胞污染；,121,Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (2),污染来源： 不洁动物标本； 空气：操作室与

40、超净台的过滤设备老化； 器械灭菌不彻底； 人员操作； 血清；,122,Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (3),污染物鉴别： 肉眼观察； 光学显微镜观察； 电子显微镜观察； 特殊培养观察：支原体,123,Keep free from biological contamination 七. 防治污染,污染源 治 理 细 菌 青霉素（200umL-1),链霉素（200g mL-1) 真 菌 制霉菌素（100u mL-1) 支原体 卡那霉素（100 g mL-1，不能根除) 病 毒 ？ 其它细胞 1.同一工作面不能有其它细胞系存在； 2.

41、两种细胞系不能共用培养器具；,124,Long-term conservation of cell culture 八. 细胞培养物的长期保存,传代法：Carrel使鸡胚心细胞传3400次，34年; 液氮法： 培养细胞 甘油/二甲亚砜（510%）,混匀,安瓿封装,细胞/安瓿,降温至-30 （13 /min ）,降温至-150 （1530 /min ）,置液氮（-196 ）中,低温保存细胞,125,Anabiosis of Cell细胞复苏,取出安瓿，投入37 水浴，轻摇， 重新形成细胞悬液 （注意防护）,126,Section 2 Fusion of Animal Cells第二节 动物细胞融

42、合,1958年，日本冈田善雄意外发现经UV灭活的仙台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合； 1960年，法国Barski发现两种不同类型细胞混合培养会自发形成融合细胞； 1965年，冈田善雄等采用灭活的仙台病毒融合产生第一个动物种间异核体； 1966年，Yerganian用相同的方法获得能增殖的杂种细胞；,127,Animal Cell Fusion Induced by Virus病毒诱导融合,双亲本细胞 灭活仙台病毒（疱疹病毒，副黏液病毒） 细胞沉淀 细胞凝集 各种融合子,混匀，冰浴20min，稍摇,37 ,30 min,洗涤,选择培养基,所需的融合子,分别制悬液,混合离心,128,Cell

43、Fusion Induced by Chemicals化学诱导融合,1974年，高国南发现PEG能诱导植物细胞原生质体融合； 1975年，Pontecorvo用PEG法融合动物细胞成功； 悬浮法 PEG4000 4050%，处理12 min; 离心法 PEG1000 3040%，离心58 min; (可加515% 二甲亚砜）,129,电激诱导融合,与植物原生质体相同,130,Screening Hybrid Cells杂种细胞筛选,抗药筛选 营养缺陷筛选,131,Application of Cell Fusion细胞融合的应用,基因定位; 体细胞杂种致瘤性分析; 遗传缺陷的基因互补研究; 分

44、化功能表达调控;,132,Section 3 Monoclonal antibody produced by lymphocyte hybridoma第三节 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体,抗原 记忆细胞 B淋巴细胞 （脾）浆细胞 特异抗体 融和 小鼠骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞,2002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓瘤细胞升空进行细胞融合实验,特异抗体,产生,产生,筛选,133,淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体技术示意图,134,Screen of hybridoma杂交瘤细胞的筛选(1),HGPRT基因缺陷的肿瘤细胞不能在含HAT的选择培养基上生长； B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外

45、生长。 利用这两种细胞各自的特点，筛选能在体外含HAT的培养基中生长的融合子。,HGPRT: 次黄嘌呤核糖磷酸转移酶 HAT： 次黄嘌呤，氨基喋呤，胸腺嘧啶,135,Screen of hybridoma杂交瘤细胞的筛选(2),如何获得融和细胞？ 如何得到单个融和细胞？ 鉴别是否分泌所需抗体； 融和细胞的遗传稳定性；,136,Section 4 Cell Reconstruction 世界各国普遍反对克隆人;,166,克隆技术应该应用于哪些领域 新浪网调查,1克隆濒临灭绝的动物 66.32% ; 2克隆人类部分器官用于医疗62.11%; 3克隆国家保护的动物 27.37%; 4创造新的物种 1

46、7.89%; 5克隆可食用的动物 11.58%; 6克隆人类用于生活 7.37%; 7其它 5.26%,167,坚持克隆人的3位科学家,意大利医生 安蒂诺里Antinori,美国医生 扎沃斯Zavos,邪教组织“雷利安运动”的法国科学家 布瓦瑟利耶Brigitte Boisselier,168,Clone of human embryo克隆人类胚胎,英国政府2004年8月向纽卡斯尔大学颁发了世界上第一份克隆人类胚胎的合法执照，批准这所大学进行以医疗为目的的克隆人类胚胎研究。,169,Section 5 Chromosome Transfer第五节 染色体转移,微细胞（微核体）介导 微细胞(mi

47、nicell)：只含有一至几条染色体、少量细胞质和完整质膜的核质体。 优点： 简化供体； 受体细胞受影响小； 染色体很少损坏或不损坏；,170,Preparation for minicells微细胞制备,秋水仙素0.1g/mL，816h 细胞松弛素B 1 g/mL，46h 供体细胞培养 中期细胞 大小细胞悬液 12000g，10min 细胞松弛素B 10 g/mL，0.51h 39000g, 20min 含微细胞上清液 微细胞 无血清培养基悬浮 滤膜过滤 微细胞 微细胞沉淀 线性梯度BSA悬浮 分别离心 微细胞,171,Fusion between minicells and accepte

48、d cells微细胞与受体细胞融合,微细胞（百万个） 含植物凝集素P的无血清培养基 悬浮液 受体细胞 1015min，37 凝集 吸去植物凝集素P 加PEG1540 （3050%） 1 min 吸去PEG液 无血清培养基洗涤3次 1624h， 37 加完全培养基 胰酶消化，收获离散细胞 分装培养瓶 选择培养基筛选,172,Directly Chromosome Transfer 直接转移染色体,细胞同步化与染色体分离 秋水仙素处理 胰酶处理 离心 供体细胞 4 ，20min 细胞沉淀 缓冲液洗涤 破坏有丝分裂器 37 ，10min 4 ，3000rpm,10min 针筒喷射 细胞破碎液 密度梯

49、度离心 染色体 分离大小染色体 流式细胞仪,173,Chromosome Transfer染色体转移,显微注射法 细胞直接吞噬法 染色体-磷酸钙共沉淀法 染色体悬液与CaCl2（2mol/L）按16：1混匀 滴入受体细胞 20min 37 ,4h,CO2培育箱 加入完全培养基（20mL) 加二甲亚砜（30%）10mL 30s 加10mL新培养液 吸去培养液 胰酶消化 收获细胞 选择培养基,174,Lipidsome packing 脂质体包装法,乙醚-氯仿-染色体悬液2mL 37 旋转蒸发 卵磷脂-胆固醇混合液 100 000g,30min 弃上清 染色体悬液，培养液 脂质体悬液 脂质体沉淀

50、混悬液 滴加 2h 受体细胞 加PEG 吸去各液体 24h 加新鲜培养液 选择培养基,混合,175,乙醚：氯仿=1：1,107条染色体mL-1,乙醚-氯仿染色体悬液配方：,176,Prescription for chromosome suspension染色体悬液配方,NaCl 8.0 g KCl 0.2 g K2HPO4 1.15 g KH2PO4 0.2 g 无菌水定容 1000 mL,177,Section 6 Research on Human Stem Cell第六节 人干细胞研究,干细胞是动物（包括人）胚胎及某些器官中具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是重建、修复病损或衰老组

51、织、器官功能的理想种子细胞。,178,Engineering of Stem Cell干细胞工程,上世纪五十年代，科学家在畸形胎瘤中首次发现 了胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESC），从此开创了干细胞生物学研究的历程。 1970年，Martin Evans分离出小鼠胚胎干细胞并 在体外进行培养。 接着，科学家直接从病人的身上提取某种特殊的 细胞使之长成皮肤、骨胳和软骨，甚至是重要器 官的一部分，这类细胞就是干细胞。 1997年人的胚胎干细胞被首次培养成功，从而科 学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞工 程，即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。,179,全能性干细胞（胚

52、胎干细胞）； 多能性干细胞 ； 专一性干细胞；,Types of Stem Cells干细胞的类型,180,Types of Stem Cells （1）,全能性干细胞： 即受精卵及胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育成为人体全部206种组织和细胞甚至形成完整个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。,181,Types of Stem Cells （2）,多能性干细胞：这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成至少12种血细胞，但一般不能分化出造血系统

53、以外的其它细胞。（这种观点已受到质疑）,182,Differentiation of Hematopoietic Stem Cell造血干细胞分化,183,Types of Stem Cells （3）,专一性干细胞： 这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌细胞等。 （这种观点已受到质疑）,184,Characters of Stem Cell,具有分裂成其它细胞的可能性； 具有无限增殖分裂的潜能； 可连续分裂几代，也可在较长时间内处 于静止状态； 以对称或不对称两种方式进行生长。,185,Three Steps on the Res

54、earch of Stem Cell,获得干细胞系 ; 建立干细胞诱导分化模型 ; 将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织，考察其效果。,186,Three Steps on the Research of Stem Cell （1）,获得干细胞系： 这是本研究最重要的第一步。可以从动物或人的早期胚胎或各器官、组织中分离并经鉴定，且能在体外长期保持干细胞特性（一般应稳定传25代以上）；,187,Three Steps on the Research of Stem Cell （2）,建立干细胞诱导分化模型： 可利用基因工程手段引入外源目的基因（对原有致病基因进行置换改造），探

55、索诱导干细胞向特定组织、器官分化的化学或/和物理条件；,188,Three Steps on the Research of Stem Cell （3）,将上述干细胞或干细胞培育体系植入动物或人的相应器官或组织中，考察其效果。,189,Therapy Comparison between Traditional and Stem Cell,低毒性（或无毒性），一次治疗有效; 不需要完全了解疾病发病的确切机理; 用自身干细胞移植，可避免产生免疫 排斥反应；,190,Argue with Stem Cell,Embryo Stem Cell; Somatic Stem Cell;,191,坑人？救

56、人？,英国2000年通过了准许在严格管理的条件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究； 美国总统布什在2001年8月宣布，美国政府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行研究； 德国只允许研究2002年1月30日以前产生的胚胎干细胞，而且还必须是在没有其它可选择的情况下才能进行。,192,中国支持治疗性克隆研究,中科院副院长陈竺院士2002年7月指出：“一个体外的胚胎在有限的时间，如14天里，尚属一般的生物细胞，此时还没有神经细胞和脑细胞的产生，既无知觉也无感觉，因此科学界一般认为它在此时还不是一个道德意义上的人。人类干细胞研究给21世纪医学的革命性发展带来可能，因此总的平衡利弊，还是要支持”。 陈竺副院长还强调，在支持的同时还要有严厉的法律、法规来保证这样的技术发展能真正造福人类。,193,前程无量的干细胞工程,干细胞巨大的潜在应用价值引起世界许多国家和机构的高度重视，他们投入巨资进行研究，陆续取得了一系列重大的发现，导致1999年12月美国科学杂志将人类干细胞的研究评为当年十大科学成就之首。,194,干细胞器官工程的难点,地球重力限制了细胞的三维生长； 离体培养难以确保器官形成所需的多种条件； 细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究清楚；,195,国际领先的徐荣祥,2002年08月:5年内克隆人体所有器官,196,国际领先的徐