初始污染菌检查20120330.ppt

1、初始污染菌检查,凌真 Tel扬州药品检验所 药理室 2012-3-30,生物学检查,初始污染菌检查 空气中细菌总数检测方法 物体表明和生产人员手细菌总数检测方法,初始污染菌检测,指标含义（！）,通过测定检品细菌总数可用来判明检品细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对检品进行卫生学评价的综合依据。,初始污染菌检测,目的：保证灭菌的效果，确定灭菌剂量，监控灭菌过程的有效性。 引用标准： GB7918.2 化妆品微生物标准检验方法 细菌总数测定 GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 中华人民共和国药典2010版

2、附录 微生物限度检查法,GB7918.2,细菌总数指1g或1ml化妆品（检品）中所含的活菌数量，测定细菌总数可用来判明化妆品（检品）被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者（生产工人手细菌总数）的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。,GB15980-1995,规定了一次性使用医疗用品灭菌、消毒前、后的卫生标准。对一次性使用医疗用品（包括灭菌和消毒的一次性使用医疗用品）生产企业中生产、装配、包装车间（空气中细菌总数检查方法）等生产过程和生产工人手提出卫生要求的质量控制。,检测环境 和检验量,在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向空气区域内进行。

3、洁净区设置可在微生物室操作 各类产品每批随机抽样10件样品（10个包装）,方法主要步骤,采样,供试液制备,培养,菌落计数,初始污染菌检测,采样方法,供试液制备,供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10的供试液。 2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。作为1：10的供试液。 3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。作为供试液。 4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2010年规定进行) 5. 对有内腔的医疗

4、用器:用定量洗脱液，无菌操作冲洗内腔，反复冲洗，充分振落后 取样。 6. 对一次性输液（血）器的零配件及其他医疗器械:直接用定量洗脱液（1ml/10cm2）冲洗，将洗脱液置于无菌容器中，充分振荡后取样。,初始污染菌检测,梯度稀释,1ml,1ml,1ml,1ml,1ml,供试液,9mlNacl,9mlNacl,1:10,1:100,1:1000,检验方法,将每样取5份平行样（取一份样品，根据限值制备好供试液后，取5份1:10，取5份1:100，取5份1:1000，）,初始污染菌检测,结果计算公式： 平均菌落数稀释倍数菌数 菌数/每件次（或g） = 件次或重量（g） 注意事项： 供试品的取样必须在

5、万级环境中100级净化条件下，无菌操作，防止污染。 应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。,产品初始污染菌数限值：,灭菌产品管道类内腔10cfu/件次，外部100cfu/件次，非管道类100cfu/件次，敷料类100cfu/g；消毒产品1000cfu/件次或重量（g）,初始污染菌检测,供试液制备,推荐的制备方法,样 品 制 备,供试液制备,梯度稀释,加 样,用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取10g，移入100ml灭菌生理盐水中，不时振摇。作为1：10供试液。,供试液10倍递减稀释。 尽量避免丝线等杂物的混入。,（1）每个稀释级各吸取1ml至每个灭 菌平皿，每个稀释级注5个平皿。 （2）经灭菌

6、完毕的营养琼脂培养基冷却至45-50 时，倾注上述各个平皿15ml，另倾注一个注入1ml稀释液（灭菌生理盐水）灭菌空平皿作阴性对照。按一个方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。,纱布模拟,培养,琼脂凝固后，倒置，37 培养48h,细 菌 计 数,基本概念,细菌数测定是微生物的定量检查，对非规定灭菌产品中污染的活菌数量进行测定，通常以每克或每毫升供试品作为计量单位。,限制条件,平板菌落计数法的特点是先使细胞分散、定位，增生可见菌落后计数。它是一种有条件的计数法，其限制条件大致如下： 以菌落数为基础。 CFU(colony forming units):一个菌落就是一个细菌形成单位，它 可以

7、由一个也可以由多个菌细胞形成。 受特定培养基和培养条件限制。 有繁殖能力的菌细胞才能认定“活菌”。,细菌计数,先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5-10倍的放大镜检查，以投射光衬以暗色背景，以防遗漏（可辅助菌落计数器）记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数（每个稀释度的5个平板值，相加后除以5）。 若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数，若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。,菌落特征, 形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、 淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC(

8、氯化三苯基四氮唑试剂)，菌落为红色） 边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。 大小差异很大。,1、选取平均菌落数在30300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。 如只有1个稀释级平均菌落数在30300之间，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。 2、如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30300之间，则先计算两稀释级菌落数的比值。 高稀释级的平均平板菌落数稀释倍数 比值= 低稀释级的平均平板菌落数稀释倍数 当比值2时，则以2个稀释级的平均菌落数均值报告。 当比值2时，则以低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 补充：如有3个稀释级，平均菌落数均在30300之间，则以后2级计算级间比

9、值报告。（增加解释2）,菌落计数基本规则,3、如各稀释级平均菌落数均在300以上，则按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告；如各稀释级平均菌落数均在30以下，则按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。 4、如各稀释级平均菌落数均不在30300之间，则以最接近30或300的稀释级平均菌落数乘以稀释倍数报告。 5、如各稀释级平均菌落数均无菌落生长或最低稀释级平均菌落数小于1时，应报告菌数为10个/g或ml。 6、菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告。大于100时，采用二位有效数字，在两位有效数值后面，应以四舍五入法计算。在报告菌落数为“不可计”时，应表明样品的稀释度,细菌计数结果

10、及报告方法,空气中细菌总数检测方法,测定空气中动态下细菌总数。 采用平板暴露法：车间在30m2以上者，于东、西、南、北（距墙1m处）、中五点；小于30m2者，于一条对角线里、中、外三点，高度均在1.5m处采样，将普通营养琼脂平板（9cm直径）按上述采样点和高度布放，暴露15min后立即关盖，于37温箱培养24h后观察后果，求出5个或3个采样点的平均菌数,计算公式,菌数/m3= 式中： A平板面积，cm2； T平板暴露时间，min； N平均菌落数。 标准限值：灭菌和消毒产品分别500和2000cfu/m3,物体表面和生产人员手细菌总数检测方法,采样方法: 将内径为5cm5cm的灭菌规格板，放在被检物体表面，根据物体表面积大小，采平行样14个，用浸有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次（往返计为1次），将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的采样管中。 对生产人员手采样：被检人五指并拢，将浸有灭菌生理盐水的棉拭子在右手指曲面，从指尖、甲沟至指根处往返涂抹10次后，将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水的试管中