荧光定量PCR仪器简介liuyiPPT课件.ppt

1、.,1,荧光定量PCR仪器简介,湖南圣湘生物科技有限公司 刘昳,.,2,主要内容,.,3,.,4,945772,水浴锅PCR,荧光定量PCR,金属浴锅PCR,1、PCR仪的发展历史,.,5,2、荧光定量PCR仪的发展历史,Perkin-Elmer Cetus仪器公司推出第一台热循环仪,ABI Prism 7700第一个高通量的实时荧光PCR仪,Bio-Rad iCycler,2000年后更多质优价廉的仪器进入市场，通量更高,1985.11,1996年,1998年,1999年,2000年,ABI推出7900HT荧光定量PCR仪,Roche 推出第一台全自动荧光定量PCR仪Lightcycler

2、1.0,.,6,3、荧光定量PCR仪的组成,一台PCR仪主要由控温系统和光源系统两大组件构成。,.,7,4、荧光定量PCR仪的原理,Taqman 探针,.,8,4、荧光定量PCR仪的原理,.,9,5、荧光定量PCR仪的应用,基础科学研究 疾病检测与治疗检测、预后 优生优育及遗传筛查 基因表达分析 临床医学应用 肿瘤分型/耐药性评估 食品卫生检疫及安全评估,医院检验科、感染病科等 疾控中心 血站、血液中心 研究所等机构 食品监督管理局 海关进出口检疫,.,10,高端市场,低端市场,5、荧光定量PCR仪的市场情况,.,11,高通量,高速度,自动化,灵活化,4,3,2,1,互联网化,5,6、荧光定量

3、PCR仪的发展趋势,.,12,.,13,1、硬件组成,光学系统： 激发光源和 检测系统； 热循环系统： 加热和制冷系统； 信号处理系统；,.,14,2、激发光源比较,.,15,Laser: 高强度, 波长范围窄 Tungsten lamp: 中等光强, 波长范围宽 Light emitting diode: 低的光强，波长范围窄,2. 激发光源比较,.,16,2. 激发光源比较,.,17,3、检测装置比较,.,18,3、检测装置灵敏度比较,PMT 可以检测到很宽的波长范围，并对信号有放大作用 CCD 检测范围宽, 易受背景信号噪音影响, 整体检测时间较长 光电二极管可以检测到很宽的波长范围,

4、检测灵敏度低,冷CCD装置与普通CCD相比： 冷CCD能降低图像噪音，提高图像质量和灵敏度。,.,19,3、检测装置PMT和CCD检测原理比较：,光信号得以扩增. 获得更大的检测信号和更高的灵敏度 无边缘效应,光子释放出电子，使检测器留下一个带正电荷 正电荷记数作为检测信号 信号没有得以放大 有边缘效应,.,20,4、加热系统：空气加热,速度快；管间温度均一性好；无需金属的精密加工；成本低； 对环境温度要求高：不能低于室温（15 - 35）; 灵活性差：不能做温度梯度； 样本数量少（罗氏毛细管32个）。,.,21,金属热块的加热和降温分别通过电阻丝和半导体来控制。 特点： 温控范围大（ 4 t

5、o 99） ，均一性（0.5 ）； 灵活性好：可以做温度梯度； 样本数量多（96孔和384孔)； 但其加热速度比空气加热稍慢。,4、加热系统：半导体加热系统,.,22,风扇制冷 压缩机制冷 半导体制冷,5、制冷系统,.,23,6、荧光定量PCR仪的性能目标,.,24,.,25,PCR仪的家族成员,进口 美国应用生物系统公司（ABI ） 美国伯乐（Bio-rad） 瑞士罗氏（Roche） 美国安捷伦（Agilent） 德国凯杰（Qiagen） 德国艾本德（Eppendorf） 韩国柏业（Bioneer）,国产 杭州博日（Bioer ） 上海宏石（Slan） 西安天隆（Tianlong） 上海枫岭

6、（Funglyn） 厦门安普利（Amplly） 广州达安（DA） 上海科华（Fluocycler）,.,26,.,27,2007年：ABI Step one/Plus,2010年：ABI ViiA 7,.,28,ABI 仪器光学路径,.,29,Rox：(5-carboxy-x-rhodamine) 5-羧基-X-罗丹明,样本1,样本2,Rox的功能： 1）校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变； 2）为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响； 3）均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异； 4）均一化校正批间体积差异，提供更连续一

7、致的批间重复Ct值。,ABI 仪器：校正染料ROX,.,30,ABI 仪器：校正染料ROX的效果,.,31,各款ABI主流荧光定量PCR的特点,.,32,罗氏定量PCR仪大家族,Light cycler 1.5,Light cycler 2.0,Light cycler 480,Light cycler nano,Light cycler 1536,罗氏Cobas Ampliprep,.,33,空气后通过加热元件加热，热空气经过风扇的作用进入循环腔内；通过风扇的调节来保证空气循环和温度的均一性；加热时，风扇低速运转从而使得腔内的温度均匀；冷却时，风扇高速运转使加热枪和毛细管降温。,Roche

8、LC1.5/2.0荧光定量仪特点,.,34,Roche LC 1.5/LC2.0性能参数,.,35,Roche LC480 热循环系统组成和特点： Thermal Block Cycler包括了样本底座（96孔或384孔），Peltier元件，配合Therma-BaseTM 热均衡器，银质散热块和电子元件。 Block cycler cover (热盖） Multiwell plate loader, Multiwell plate detector, Multiwell plate bar-code scanner (条形码扫描装置）， Block Cycler door with fans

9、.,热盖,微孔板模块 Peltier 半导体加热单位 冷却装置 Therma-BaseTM,Roche LC 480,.,36,Roche LC 480特有的温控元件Therma-Base,Therma-Base是一种热均衡器。 封闭的真空夹层，内壁为灯芯式结构，存贮工作液； 通过一系列的蒸发和凝结过程来调节控制温度,提升导热效率，提高孔间温度均一性，孔间温度的精确度0.1C 快速冷却和加热速度 Heating: (4.8) C/s Cooling: (2.5)C/s 整个板的精确 PCR 结果 96孔模式 1 hour 384孔模式 40 min,多孔板座,Peltier元件,冷却装置：银质

10、散热鳍,Therma-Base层,.,37,光源：Xenon-lamp,Roche LC 480光学系统组成及特点 激发和发射滤镜轮： 5个激发波长和6个检测波长；半峰带分别为25-40nm和20nm；,氙灯：激发波长从330nm到630nm；需预热两分钟；平均寿命至少500个小时；易更换。,冷CCD(1204x1344), 温度被控制在10左右，降低了热噪作用。,Roche LC480 光学系统特点,.,38,光路特点： 如何解决边缘效应？,光源太近： 光强度够了，但边缘光信号根本无法收集；,光源太远： 整体光强度不够，且边缘信号弱。,.,39,Roche LC 480 独有的compact

11、 instrument:,两个解决办法： Field lens :具有很好的光透性和光收集能力；使得激发和检测光的保持良好均一性；光线以近乎直角的角度经过热盖孔射到每个孔中； 2. 特殊的光路设计使样本与CCD达到最佳光程位置，光经过多次折射后到达检测系统。, 孔间无阴影效应 很好地收集孔边缘光，不会造成边缘光的失真或变化,保证了整板的均一性和灵敏度,.,40,MyIQ单色PCR,Bio-rad IQ5,Bio-rad I Cycler,MJ Opticon2,Bio-rad CFX-96,伯乐定量PCR仪大家族,.,41,Bio-Rad Real Time PCR 仪性能特点,.,42,安捷

12、伦定量PCR仪大家族,Strategene Mx3000P,Strategene Mx3005P,2001年，Strategene Mx3000P,2007年，安捷伦收购Strategene。,.,43,Mx3000p荧光定量PCR仪硬件,.,44,热循环系统特点： 半导体控温制冷（Peltier 控温） 热盖加热 升降温速度2.5/s 温度均一性和准确性：0.25,.,45,光学系统特点：, 1 使用PMT光电倍增管 （提高灵敏度且无边缘效应） 2 光纤维扫描激发和检测 3 光源：卤钨灯,.,46,扫描式检测模式：,恒定的强度，没有位置的相关性；,1. 所有96孔都用相同强度的光扫描，因此没

13、有激发的差别 2. 所有96孔的发射光都经过相同的距离传输给PMT，因此没有检测距离的差别,避免了个样品间的光程差，无需内参校正。,整板读取 3.5 秒；4通道的扫描16秒；5通道的扫描要20秒 选择不同的染料后，分别扫描 滤镜轮转动 16 bit PMT 检测荧光,.,47,ROTOR Gene 3000,ROTOR Gene 6000,ROTOR Gene Q,凯杰定量PCR仪大家族,2008年，Qiagene收购Cobbert。,.,48,LED激发,PMT检测,反应仓-空气流动使温度上升下降,.,49,主要特点： 空气加热，升温（15/s) 和降温(20 /s)速度快； 每通道独立LE

14、D灯光源，和滤光片，多达6个通道（365-680nm激发，460-750nm检测）； PMT检测，增益可调； 提供Rotor0DiscTM OTV进行光学温度校验； 36-well Rotor,72-well Rotor,0.2ml普通PCR管，0.1ml四联管；,Rotor-Gene Q实时荧光定量PCR仪-Qiagen,.,50,其他进口PCR仪,艾本德Mastercycler,柏业Exicycler TM96,.,51,LINE-GENEFQD-33A,LINE-GENEFQD-66A,LINE-GENEFQD-K,LINE-GENEFQD-96A,博日定量PCR仪大家族,.,52,博日

15、PCR仪器加热模块,.,53,激发光LED,Long life maintenance-free ultra-bright,荧光检测PMT,Low Temperature Drift ultra-sensitive High-stable,博日PCR仪器光源系统,.,54,底部扫描方式，全板扫描时间少于5秒,博日PCR仪器荧光采集,.,55,SLAN-48,SLAN-96P,SLAN-96R,宏石定量PCR仪大家族,.,56,宏石slan荧光定量PCR仪,光源：LED灯 检测装置：PMT(光电倍增管） 温控系统：半导体加热/制冷 检测动力学范围：100-1010 反应体积：10ul-100ul

16、 可选择的荧光染料：FAM,SYBER;VIC,HEX,JOE,TET;ROX,TEXRAD,CY5 样本容量：48个（20ul-100ul) SFDA, CETUVISO13485认证（2003）,软件系统根据每管荧光值大小，自动选择增益值，无需手动设置； 检测灵敏度高，荧光背景值低，无需光学及背景校正。,.,57,Slan 的独特检测模式： 独立光纤传导扫描 侧面检测,提高了荧光采集效率，减小孔间荧光干扰 侧面检测，相对顶部透光，降低了对管盖透光性的要求,.,58,.,59,Genelight2400,Genelight9800,安普利定量PCR仪大家族,.,60,达安DA7600,达安PCR仪,光源：LED灯 检测装置：PMT(光电倍增管） 温控系统：半导体加热/制冷 检测动力学范围：100-1010 反应体积：10ul-100ul 激发波长：470nm 检测波长：530nm 、640nm 、710nm 温度范围：30-99 可选择的荧光染料：FAM,SYBER; LC640 NHS ESTER;CY5.5,TYE705 样本容量：48个（20u