第八章 生物氧化

1、第八章 生物氧化生物体内，物质常可通过加氧、脱氢、失去电子的方式被氧化。营养物质经柠檬酸循环或其他代谢途径进行脱氢反应，产生的成对氢原子（2个氢质子和2个电子）以还原当量NADH+H+或FADH2的形式存在，是生物氧化（biological oxidation)过程中产生的主要还原性电子载体。机体在进行有氧呼吸时，这些还原性电子载体通过一系列的酶催化和连续的氧化还原反应逐步失去电子（电子传递），最终使氢质子与氧结合生成水。同时释放能量，驱动ADP磷酸化生成ATP，供机体各种生命活动的需要。第一节 氧化呼吸链是由具有电子传递功能的复合体组成生物体将NADH+H十和FADH2彻底氧化生成水和ATP

2、的过程与细胞的呼吸有关，需要消耗氧，参与氧化还原反应的组分由含辅助因子的多种蛋白酶复合体组成，形成一个连续的传递链，因此称为氧化呼吸链（oxidative respiratory chain)。真核细胞ATP的生成主要在线粒体中进行，在氧化呼吸链中，参与传递反应的酶复合体按一定顺序排列在线粒体内膜上，发挥传递电子或氢的作用。其中传递氢的酶蛋白或辅助因子称之为递氢体，传递电子的则称之为电子传递体。由于递氢过程也需传递电子（2H+2e），所以氧化呼吸链也称电子传递链（electron transfer chain)。一、氧化呼吸链由4种具有传递电子能力的复合体组成氧化呼吸链是由位于线粒体内膜上的4

3、种蛋白酶复合体（complex)组成，分别称之为复合体I、II、III和IV。每个复合体都由多种酶蛋白和辅助因子（金属离子、辅酶或辅基）组成，但各复合体含有自己特定的蛋白质和辅助因子成分（表8-1）。各复合体中的跨膜蛋白成分使其能够镶嵌在线粒体内膜中，并按照一定的顺序进行排列（图8-1）。其中复合体I、III和IV镶嵌于线粒体内膜的双层脂质膜，而复合体II仅镶嵌在双层脂质膜的内侧。复合体中的蛋白质组分、金属离子、辅酶或辅基共同完成电子传递过程，主要通过金属离子价键的变化、氢原子（H+e）转移的方式进行。电子的传递过程本质上是由电势能转变为化学能的过程，电子传递过程所释放的能量驱动H+从线粒体基

4、质移至膜间腔，形成跨线粒体内膜的H+浓度梯度差，用于驱动ATP的合成。下面将分别叙述氧化呼吸链各复合体中主要酶蛋白或辅助因子的氧化还原作用及相应的电子传递过程。175176 第二篇 物质代谢及其调节（一）复合体I将NADH+H中的电子传递给泛醌复合体I又称NADH一泛醌还原酶或NADH脱氢酶，接受来自NADH+H+的电子并转移给泛醌（ubiquinone）。在柠檬酸循环和脂肪酸一氧化等过程的脱氢反应中，大部分代谢物脱下的2H是由氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）接受，形成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH+H）。NAD+

5、(图8-2)是脱氢酶类的辅酶，分子中烟酰胺芳环中的氮为五价，易接受电子被还原，还原时能接受2H中的双电子成为三价氮，同时芳环也接受一个氢质子进行加氢反应，为双电子传递体。烟酰胺在加氢反应时只能接受1个氢质子和2个电子，游离出一个H+在溶液中，因此将还原型的NAD+写成NADH+H+（NADH）（图8-3）。还原型NADH可失去电子被氧化而生成NAD+，其电子被复合体I接受并传递给泛醌。复合体I由黄素蛋白（flavoprotein )、铁硫蛋白（iron-sulfur protein)等蛋白及其辅基组成，呈L形，一端突出于线粒体基质中，包括黄素蛋白及黄素单核苷酸（flavin mononucle

6、otide，FMN）辅基和2个铁硫中心( iron-sulfur center, Fe-S )辅基、铁硫蛋白及其3个Fe-S辅基；嵌于内膜的横臂为疏水蛋白部分，也含1个Fe-S辅基。所以，黄素蛋白和铁硫蛋白都能通过辅基发挥传递电子作用。FMN分子中含核黄素（维生素B2），结构中的异咯嗪环可接受1个质子和1个电子形成不稳定第八章 生物氧化 177的FMNH，再接受1个质子和1个电子转变为还原型FMNH2。反之，FMNH2氧化时也逐步脱去电子和质子，属于单、双电子传递体（图8-4）。氧化呼吸链含有多种铁硫蛋白，其中的Fe离子通过与无机硫(S)原子或（和）铁硫蛋白中的半胱氨酸残基的S原子相连，形成铁

7、硫中心。（Fe-S，图85）。Fe一S可有多种形式，最简单的铁硫中心是1个Fe离子与4个半胱氨酸残基的S原子相连，而复杂的铁硫中心可以含2个、4个Fe离子并通过无机S原子及半胱氨酸残基的S原子相连（如Fe2 S2，Fe4 S4）铁硫中心的铁离子可进行Fe 2+Fe3+e一的可逆反应，每次传递一个电子，因此铁硫蛋白为单电子传递体。复合体I中黄素蛋白辅基FMN从基质中接受还原型NADH中的2个质子和2个电子生成FMNH2，经一系列铁硫中心，再经位于线粒体内膜中疏水蛋白的铁硫中心将电子传递给内膜中的泛醌。泛醌又称辅酶Q (coenzyme Q，CoQ，Q），是一种小分子、脂溶性醌类化合物。泛醌结构中

8、含多个异戊二烯单位形成较长的疏水侧链。人的CoQ侧链含10个异戊二烯单位，用CoQ10（Q10）表示。泛醌脂溶性强，能在线粒体内膜中自由扩散，不包含在上述复合体中。泛醌和FMN178 第二篇 物质代谢及其调节类似，能进行可逆的电子传递，有3种氧化还原状态，接受1个电子和1个质子还原成半醌型泛醌（QH），再接受1个电子和1个质子还原成二氢泛醌(QH2），后者可逆向逐步失去质子和电子再被氧化为泛醌（图8-6）。由于泛醌能在线粒体内膜中自由移动，同时传递氢和电子，可在各复合体间募集并穿梭传递还原当量，在氧化呼吸链中具有重要作用，同时还在下述的电子传递和质子移动的偶联中起着核心作用。复合体I可催化两个

9、同时进行的过程：将一对电子从还原型的NADH传递给泛醌的过程中，可同时偶联质子的泵出过程，将4个H+从内膜基质侧（negative side，显负电,N侧）泵到内膜胞质侧(positive side,显正电,P侧），故复合体I有质子泵功能，泵出质子所需的能量来自电子传递过程。（二）复合体II将电子从琥珀酸传递到泛醌复合体II是柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，又称琥珀酸一泛醌还原酶，其功能是将电子从琥珀酸传递给泛醌。人复合体II又称黄素蛋白2 (FP2），由4个亚基组成，其中2个小疏水亚基，将复合体锚定于内膜；另外2个亚基位于基质侧，含底物琥珀酸的结合位点、3个铁硫中心辅基和1个黄素腺嘌呤二核苷酸（

10、FAD）辅基。FAD的结构母核与FMN相同，也是通过异咯嗪环进行电子传递。琥珀酸的脱氢反应使FAD转变为还原型FADH2，后者再将电子传递到铁硫中心，然后传递给泛醌。该过程传递电子释放的自由能较小，不足以将H+泵出线粒体内膜，因此复合体II没有H泵的功能。代谢途径中另外一些含FAD的脱氢酶，如脂酰CoA脱氢酶、一磷酸甘油脱氢酶、胆碱脱氢酶，可以不同方式将相应底物脱下的2个H和2个电子经FAD传递给泛醌，进入氧化呼吸链。（三）复合体III将电子从还原型泛醌传递至细饱色素c泛醌从复合体I或II募集还原当量并穿梭传递到复合体III，后者再将电子传递给细胞色素c，因此复合体皿又称泛醌一细胞色素c还原酶

11、。人复合体III含有细胞色素b（b562，b566）、细胞色素c1和一种可移动的Rieske铁硫蛋白（Rieske iron-sulfur protein)。细胞色素（cytochrome, Cyt）是一类含血红素样辅基的电子传递蛋白，血红素样辅基中的铁离子可通过Fe2+Fe 2+e一反应传递电子，为单电子传递体。还原型细胞色素均有特征的、三个可见吸收峰。而氧化型细胞色素吸收峰和还原型的相比有明显改变，可作为分析细胞色素种类和状态的重要指标。根据它们吸收光谱和最大吸收波长不同，可将线粒体的细胞色素分为细胞色素a,b,c（Cyt a,Cyt b,Cyt c)三类，及不同亚类。各种细胞色素光吸收性

12、质不同是由于辅基铁卟啉环的侧链以及血红素所处分子环境各有不同。细胞色素b的铁卟啉是铁一原卟啉IX，与血红蛋白的血红素相同，称为血红素b(图8-7)；而细胞色素a中铁一原卟啉IX环含有甲酰基，1个乙烯基侧链连接的聚异戊二烯长链，称血红素a(图8-7)。细胞色素a和b中的血红素与其蛋白质通过非共价键结合，但为紧密连接。细胞色素c中，铁一原卟啉IX的乙烯侧链通过共价键与蛋白质部分的半胱氨酸残基的疏基相连，称血红素c（图8-8）。人复合体III为二聚体，呈梨形。每个单体中有11个亚基，其功能区包括3部分：细胞色素b,细胞色素c1，和铁硫蛋白。其中细胞色素c1和铁硫蛋白都有球形结构域，并以疏水区段锚定在

13、线粒体内膜。细胞色素b亚基结合2个不同血红素辅基，一个还原电位较低称Cyt bL，根据吸第八章 生物氧化 179收波长称Cyt b566,，另一个电位较高称Cyt bH,，根据吸收波长称Cyt b562，位置接近于内膜基质侧。复合体III还有2个泛酪结合位点，分处内膜胞质侧和基质侧，称为QP和QN位点。复合体III的电子传递过程通过“Q循环”（Q cycle)实现。“Q循环”是为了实现双电子传递体泛酿与单电子传递体细胞色素之间的电子传递，是一个复杂的电子传递过程，最终将电子从泛酿经铁硫蛋白传递给Cytc1。每2分子QH2通过Q循环，生成1分子QH2和1分子Q.将2个电子传给2分子Cyt c1，

14、同时复合体III向膜间隙释放4H十。Cyt C是氧化呼吸链唯一的水溶性球状蛋白，与线粒体内膜外表面疏松结合，不包含在上述复合体中。Cyt c从复合体III中的Cyt c1 获得电子传递到复合体IV。（四）复合体IV将电子从细胞色索c传递给氧人复合体IV又称细胞色素c氧化酶（cytochrome。oxidase），将Cyt C的电子传递给分子氧，使其还原为H2O。人复合体IV包含13个亚基，其中亚基IIII由线粒体基因编码，是还原当量传递的功能性亚基，其他10个亚基起调节作用。亚基I呈圆柱形，含2个血红素辅基，分别称为Cyt a和Cyt a3，由a一螺旋结构支持。另外还含1个Cu离子，称CuB。

15、细胞色素a3和CuB定位接近而形成1个Fe-Cu中心。蛋白结合的Cu可发生Cu+Cu2+e一的可逆反应，也属单电子传递体。亚基II、III分别位于亚基I两侧，亚基II内膜膜间腔侧膜外域含桶状的10股片层结构，通过2个半胱氨酸残基稳定结合2个Cu离子，称CuA，形成类似Fe2S2铁硫中心的结构。而亚基III的功能主要与质子泵出有关。复合体IV中含4个氧化还原中心，即2个血红素中心（Cyt a, Cyt a3）,2个Cu位点（CuA CuB）。其中CuA中心与Cyt a中血红素的Fe定位极为接近，仅距1. 5nm,电子可由CuA中心(2个Cu离子）传递到Cyt a;而Cyt a3-CuB,形成一个

16、Fe-Cu中心，这样就形成了2CuA和Cyt a3-CuB两组电子传递单元，称为双核中心（binuclear center）功能单元。复合体IV电子传递过程是在双核中心上进行（图8-9)。Cyt c供出的电子经CuA双核中心传递到Cyt a，再到Cyt a3-CuB双核中心。需要依次传递4个电子，并从线粒体基质获得4个H+，180 第二篇 物质代谢及其调节最终将1分子O2还原成2分子H20（图8-9）。其电子传递过程为：Cyt a传递第一个、第二个电子到氧化态的Cyta3-CuB,双核中心（Cu2十和Fe3+ )，经CuB。到Cyt a3，使双核中心的Cu2十和Fe3+ 被还原为Cu+;Fe2

17、+，并使双核中心结合O2分子，形成过氧桥连接的CuB。和Cyt a3，相当于2个电子传递给结合的O2。中心再获得2个H+和第三个电子,O2分子键断开，Cyt a3出现Fe4+中间态。再接受第四个电子Fe4+还原为Fe3+并形成CuB2+和Cyt a3的Fe3+各结合1个OH基团的中间态。最后再获得2个H+，双核中心解离出2个分子H20后恢复初始氧化状态（图8-10）。生成的H20通过亚基I、III间亲水通道排人膜间腔侧。复合体也有质子泵功能，相当于每传递2个电子使2个H+跨内膜向膜间腔侧转移。由于上述O2获得电子过程产生的具有强氧化性的.O2-和O2-2中间物始终和双核中心紧密结合，不会引起对

18、细胞组分的损伤。二、NADH和FADH2是氧化呼吸链的电子供体营养物质的分解代谢中，大部分脱氢酶以NAD+，NADP+，FMN或者FAD为辅酶，用来接受从底物上脱下来的成对氢，生成还原态的NADH+H+，NADPH+H+，FMNH2和FADH2图8-3和8-4）。还原态的NADH和NADPH都是水溶性的电子载体，由于氧化呼吸链的复合体I即为NADH脱氢酶，可使线粒体NADH所携带的还原当量通过氧化呼吸链彻底氧化并释能，而NADPH的还原当量主要用于合成代谢反应。FMN或FAD是氧化呼吸链复合体中黄素蛋白的辅基，能通过氧化还原态的变化进行电子传递。由于复合体II是柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，通过

19、结合底物琥珀酸并将其还原当量传递给FAD，生成的FADH2直接进人呼吸链进行氧化释能。因此NADH和FADH2是氧化呼吸链的电子供体。根据电子供体及其传递过程，目前认第八章 生物氧化 181为，氧化呼吸链有两条途径：一条称为NADH氧化呼吸链，该途径以NADH为电子供体，从NADH+H+开始经复合体I到O2而生成H2O。电子传递顺序是：NADH复合体ICOQ复合体Cyt c-复合体O2另一条称为FADHZ氧化呼吸链，也称境拍酸氧化呼吸链，以FADH2为电子供体，经复合体B到OZ而生成Hz0o电子传递顺序是：JIM酸。复合体I -+COQ-+复合体In -+Cyt c-复合体W-.OZ呼吸链各组

20、分的排列顺序是由下列实验确定的：根据呼吸链各组分的标准氧化还原电位进行排序。简单来讲，标准氧化还原电位E0（单位：电压Volts）是指在特定条件下，参与氧化还原反应的组分对电子的亲和力大小。电位高的组分对电子的亲和力强，易接受电子。相反，电位低的组分倾向于给出电子。因此，呼吸链中电子应从电位低的组分向电位高的组分进行传递（表8-2）。底物存在时，利用呼吸链特异的抑制剂阻断某一组分的电子传递，在阻断部位以前的组分处于还原状态，后面的组分处于氧化状态。根据各组分的氧化和还原状态吸收光谱的改变分析其排列次序。利用呼吸链各组分特有的吸收光谱，以离体线粒体无氧时处于还原状态作为对照，缓慢给氧，观察各组分

21、被氧化的顺序。在体外将呼吸链拆开和重组，鉴定四种复合体的组成与排列。182 第二篇 物质代谢及其调节第二节 氧化磷酸化将氧化呼吸链释能与ADP磷酸化偶联生成ATP在机体能量代谢中，ATP作为能量载体分子，是体内主要供能的高能化合物。细胞内由ADP磷酸化生成ATP的方式有两种，一种是与脱氢反应偶联，直接将高能代谢物分子中的能量转移至ADP或GDP)，生成ATP（或GTP）的过程，称为底物水平磷酸化，已在糖代谢中叙述。而ATP形成的主要方式是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation )，即由代谢物脱下的氢，经线粒体氧化呼吸链电子传递释放能量，此释能过程与驱动ADP磷酸化生成A

22、TP相偶联，即还原当量的氧化过程与ADP的磷酸化过程相偶联，产生能量ATP。因此又称为偶联磷酸化。一、氧化磷酸化偶联部位在复合体I、内成对电子经氧化呼吸链传递所能合成ATP的分子数可反映该过程的效率。理论推测的氧化呼吸链中偶联生成ATP的部位称为氧化磷酸化的偶联部位，可根据下述实验方法及数据大致确定。（一） P/O比值一对电子通过氧化呼吸链传递给1个氧原子生成1分子H2O，其释放的能量使ADP磷酸化合成ATP,此过程需要消耗氧和磷酸。P/O比值是指氧化磷酸化过程中，每消耗1/2摩尔O2所需磷酸的摩尔数，即所能合成ATP的摩尔数（或一对电子通过氧化呼吸链传递给氧所生成ATP分子数）。研究发现丙酮

23、酸等底物脱氢反应产生NADH+H+，通过NADH氧化呼吸链传递，P/O比值接近2.5，说明传递一对电子需消耗1个氧原子且需消耗约2.5分子的磷酸，因此NADH氧化呼吸链可能存在3个ATP生成部位。而琥珀酸脱氢时，P/O比值接近1.5，说明琥珀酸氧化呼吸链可能存在2个ATP生成部位。根据NADH、琥珀酸氧化呼吸链P/O比值的差异，提示在NADH和泛醌之间存在1个ATP生成部位。而抗坏血酸底物直接通过Cyt c传递电子进行氧化，其P/O比值接近1，推测Cyt c和O2之间存在1个ATP生成部位。而另1个ATP生成部位应在泛醌和Cyt。之间。经实验证实，一对电子经NADH氧化呼吸链传递，P/O比值约

24、为2.5，生成2.5分子的ATP；一对电子经琥珀酸氧化呼吸链传递，P/O比值约为1.5，可产生1.5分子的ATP.（二）自由能变化根据热力学公式，pH 7. 0时标准自由能变化（G)与还原电位变化(E,标准还原电位表示物质对电子的亲和力，还原电位高更易于接受电子）之间有以下关系：G-nFEn为传递电子数;F为法拉第常数（96.5kJ/molV）。从NAD到COQ段测得的还原电位差约0. 36V，从COQ到Cyt c电位差为0. 19V，从Cyt a,a3到分子氧为0. 58V，分别对应复合体I、的电子传递。计算结果，它们相应释放的G分别约为69.5 、36.7、112kJ/mol，而生成每摩尔

25、ATP需能约30. 5 kJ（7. 3 kcal），可见复合体I、传递一对电子释放的能量足够用于生成ATP所需的能量。说明以上三部位各存在1个ATP的偶联部位。这里讲的偶联部位并非意味着这三个复合体是直接生成ATP的部位，而是指经由这三个复合体的电子传递所释放的能量具有合成ATP的能力。由于不同复合体的电势能不同，我们可以将它们形象的比喻为由不同的蛋白质复合体组成的一个“生物电场”。电子的传递过程就是由低电势向高电势泳动的过程。而电子传递所释放的电势能就转变为跨线粒体内膜的质子浓度梯度，驱动ATP合成。二、氧化磷酸化偶联机制是产生跨线粒体内膜的质子梯度1961年英国科学家P. Mitchell

26、提出的化学渗透假说(chenmiosmotic hypothesis）阐明了氧化磷第八章 生物氧化 183酸化偶联机制。其基本要点是电子经氧化呼吸链传递时释放的能量，通过复合体的质子泵功能，驱动H十从线粒体基质侧泵出至内膜的膜间腔侧。由于质子不能自由穿过线粒体内膜返回基质，这种质子的泵出引起内膜两侧的质子浓度和电位的差别（膜间腔侧质子的浓度和正电性高于线粒体基质），从而形成跨线粒体内膜的质子电化学梯度（H浓度梯度和跨膜电位差），储存电子传递释放的能量。当质子顺浓度梯度回流至基质时驱动ADP与Pi生成ATP。如一对电子自NADH传递至氧可释放约-220kJ/mol的能量，同时将10个H+从基质转

27、移至内膜膜间腔侧，形成的H梯度储存约-200kJ/mol，当质子顺浓度梯度回流时用于驱动ATP合成。框8一1化学渗透理论阐明了氧化磷酸化偶联机制英国学者P. Mitchell获得1978年诺贝尔化学奖，表彰他创建的化学渗透理论阐明了氧化磷酸化的偶联机制。他提出电于传递能量驭动质子从线粒体基质转移到内膜外，形成跨内膜质子梯度，储存能量，泵出的质子再通过ATP合酶内流释能催化ATP合成。该理论解释了氧化磷酸化中电子传递链蛋白、ATP合酶在基质内膜分布的意义及其如何利用质子作为能源。这一理论是解决生物能学难题的重大突破，并更新了人们对涉及生命现象的生物能储存、生物合成、代谢物转运、膜结构功能等多种问

28、题的认识。化学渗透假说已经得到广泛的实验支持：氧化磷酸化依赖于完整封闭的线粒体内膜；线粒体内膜对H十、OH-、K+、C1-离子是不通透的；电子传递链可驱动质子移出线粒体，形成可测定的跨内膜电化学梯度；增加线粒体内膜外侧酸性可导致ATP合成，而阻止质子从线粒体基质泵出，可降低内膜两侧的质子梯度，虽然电子仍可以传递，但ATP生成却减少。氧化呼吸链电子传递过程驱动质子从线粒体基质侧转移到膜间腔侧的机制虽已有叙述，但还不完全清楚。实验证实电子传递过程复合体I、和有质子泵功能，一对电子经这些复合体传递分别向内膜膜间腔侧泵出4H+,4H+和2H+。图8-11归纳了氧化呼吸链电子传递和氧化磷酸化的过程。18

29、4 第二篇 物质代谢及其调节三、质子顺浓度梯度回流释放能量用于合成ATP由呼吸链中复合体质子泵作用形成的跨线粒体内膜的H十浓度梯度和电位差，储存电子传递释放的能量。当质子顺浓度梯度回流至基质时，储存的能量被ATP合酶（ATP synthase )充分利用，催化ADP与Pi生成ATP。在线粒体内膜上的复合体V (complex V），即为ATP合酶。ATP合酶是多蛋白组成的蘑菇样结构，含F1（亲水部分F1表示第一个被鉴定的与氧化磷酸化相关的因子）和F0（疏水部分，F0表示寡霉素敏感）两个功能结构域。F1为线粒体基质侧的蘑菇头状突起，催化ATP合成；而F0的大部分结构嵌人线粒体内膜中，组成离子通道

30、，用于质子的回流。动物细胞中，F1部分由33亚基复合体和OSCP,IF1等亚基组成，OSCP为寡霉素敏感蛋白（oligomycin sensitive conferring protein，OSCP，易与寡霉素结合而失去活性），F1可调节ATP合成。33亚基间隔排列，像橘子瓣样围绕亚基形成六聚体，每个亚基有1个催化中心，用于ATP的合成，但亚基必须与亚基结合才有活性，因此亚基配对结合，形成功能单元。F0镶嵌在线粒体内膜中，它由疏水的a、b2、c9-12亚基组成，形成跨内膜质子通道。动物细胞F0还有其他辅助亚基。c亚基由短环连接的2个反向跨膜一螺旋组成,9一12个c亚基围成环状结构;a亚基紧靠c

31、亚基环外侧，由5个跨膜一螺旋形成2个半穿透线粒体内膜的、不连通的亲水质子半通道，两个开口分别位于线粒体的基质侧和内膜的膜间腔侧，两个半通道分别与1个c亚基相对应（图8-12）。目前认为,ATP合酶由F0和F1组装成可旋转的发动机样结构，完成质子回流并驱动ATP合成。F0的2个b亚基通过长亲水头部域锚定于F1的亚基，并通过亚基和33稳固结合，而b亚基的疏水端锚定F0中的a亚基，使a、b2和F1中的33、亚基组成稳定的定子部分。F1部分和亚基共同形成中心轴，上端穿过33的六聚体，可与亚基疏松结合，下端伸人嵌第八章 生物氧化 185于内膜的c亚基环装结构中并与之紧密结合，使c亚基环、，和亚基组成转子

32、部分。当质子顺梯度穿内膜向基质回流时，转子部分围绕定子部分进行旋转，使F1，中的功能单元利用释放的能量结合ADP和Pi并合成ATP。质子梯度强大势能驱动质子从a亚基胞质侧进人半通道，使对应的1个c亚基中的必需天冬氨酸残基Asp 61所带负电荷被H+中和后,c亚基能与疏水内膜相互接触而发生转动，当其转到接触出口半通道相应c亚基位置时Asp 61原结合的H从半通道出口顺梯度释放进人线粒体基质（图8-12）。同理，各c亚基可依次进行上述循环，导致c环和、亚基相对33转动。在转动过程中，亚基依次和各亚基接触，其相互作用发生周期性变化，并使每个亚基活性中心构象循环改变。P. Boyer提出了ATP合成的

33、结合变构机制（binding change mechanism），p亚基有3种构象：开放型（O）无活性，与ATP亲和力低；疏松型（L)无活性，可与ADP和Pi底物疏松结合；紧密型（T)有ATP合成活性，可紧密结合ATP。亚基转动时，会依次接触3组单元中的亚基，导致亚基的构象进行协调性的、循环变化，ADP和Pi底物结合于L型亚基，质子流能量驱动合酶的转子部分进行转动，使该亚基变构为T型，用于合成ATP；再次转动使T型亚基变构为O型，则该构象的亚基释放出ATP（图8-13）。3个亚基依次经同样循环合成、释出ATP，质子流能量主要用于驱动亚基构象按顺序改变，分别结合ADP和Pi，合成的ATP可从活性

34、中心释放。目前的实验数据表明，合成1分子ATP需要4个质子，其中3个质子通过ATP合酶穿线粒体内膜回流进基质，另1个质子用于转运ADP、Pi和ATP。每分子NADH经氧化呼吸链传递泵出10H+，生成约25（10/4）分子ATP，而琥珀酸氧化呼吸链每传递2个电子泵出6H+，生成1.5（6/4）分子ATP。框8-2 Boyer破解ATP合成的可逆“结合变构”机制美国科学家P. D. Boyer获得1997年诺贝尔化学奖，他的卓越成就是破解了ATP合酶催化的分子机制。膜结合的ATP合酶存在于各种生物中，高度保守。Boyer等研究者应用化学衍生、构象探针、18O交换磷酸、定位突变等创新性实验技术，证明

35、ATP合成是可逆的“结合变构”机制（the binding change mechanism）：质子流能量主要促进酶紧密结合的ATP释放，酶内小亚基旋转驱动强制外周3个催化亚基依次结合变构。有趣的是ATP合酶是催化伴随亚基旋转的分子水平小机械，荧光蛋白标记ATP合酶的旋转已被实验直接显示证明。186 第二篇 物质代谢及其调节四、ATP在能量代谢中起核心作用生物体能量代谢有其明显的特点。其一，细胞内生物大分子体系多通过弱键能的非共价键维系，不能承受能量的大增或大量释放的化学过程，故代谢反应都是依序进行、能量逐步得失。其二，生物体不直接利用营养物质的化学能，需要使之转变为细胞可以利用的能量形式，如

36、ATP的化学能。ATP称之为高能磷酸化合物，可直接为细胞的各种生理活动提供能量，同时也有利于细胞对能量代谢进行严格调控。所谓高能磷酸化合物是指那些水解时能释放较大自由能的含有磷酸基的化合物，通常其释放的标准自由能大于25 kJ/mol，并将水解时释放能量较多的磷酸醋键，称之为高能磷酸键，用“一P，符号表示。如水解ATP末端的磷酸酷键，G为一30. 5 kJ/mol（-7. 3 kcal/mol），是高能化合物；水解葡糖一6一磷酸的磷酸醋键，其为一13. 8kJ/mol（-3. 3kca1/mol），即为普通磷酸化合物。事实上，并不存在键能特别高的化学键，相反，共价键的断裂是需要提供能量的，而高

37、能磷酸键水解时释放的能量是高能化合物底物转变为产物时，产物比底物具有更低的自由能，因而释放的能量较多。为了简便起见，仍然称之为高能磷酸键或高能磷酸化合物。此外，生物体内还包括其他的高能磷酸化合物和含有高能硫醋键的CoA等（表8-3）。（一）ATP是体内能，捕获和释放利用的重要分子ATP是体内最重要的高能磷酸化合物，是细胞可直接利用的能量形式。因此营养物分解产生的能量大约40%用于产生ATP。ATP的高能磷酸键及相应自由能可被分解或转移，生成ADP，或AMP和PPi。在标准状态下，ATP水解释放的自由能为30. 5kJ/mol (7. 3kcal/mol）。但在活细胞中,ATP,ADP和无机磷浓

38、度比标准状态低得多，而pH比标准状态的pH 7. 0高,ATP和ADP的全部磷酸基都处于解离状态，显示携带4个或3个负电荷的阴离子形式，并与细胞内Mg2+形成复合物，考虑到浓度等各种影响因素，细胞内ATP水解释放自由能可能达到52. 3kJ/mol（12. 5 kcal/mol），可用于驱动与之偶联反应的进行。因此，ATP在生物能学上最重要的意义在于，通过其水解反应释放大量自由能和需要供能的反应偶联，使这些反应在生理条件下完成。如营养物质分解代谢产生的ATP直接用于各种代谢物的活化反应、合成生物大分子的反应等，通过ATP使分解代谢与合成代谢紧密相连。另外，ATP还可直接通过水解反应为耗能的跨膜

39、转运、骨骼肌收缩、蛋白构象的改变等重要的生命过程提供能量。（二）ATP是体内能量转移和磷酸核普化合物相互转变的核心ATP末端的高能磷酸键直接水解而释能，以驱动那些需要供能的反应，同时也能从释能更多的化合物中获得能量由ADP生成ATP第八章 生物氧化 187细胞中存在的腺昔酸激酶（adenylate kinase）可催化ATP,ADP,AMP间互变。ATP+AMP一一2ADP当体内ATP消耗过多（例如骨骼肌剧烈收缩）时，ADP累积，在腺苷酸激酶催化下由ADP转变成ATP被利用。当ATP需要量降低时，AMP从ATP中获得一P生成ADP.UTP,CTP,GTP可为糖原、磷脂、蛋白质等合成提供能量，但

40、它们一般不能从物质氧化过程中直接生成，只能在核普二磷酸激酶的催化下，从ATP中获得一P产生。反应如下：ATP+UDP -ADP+UTPATP+CDP -ADP+CTPATP+GDP -ADP+GTP生物体内能量的生成、转移和利用都以ATP为中心。ATP分子性质稳定，但寿命仅数分钟，不在细胞中储存，而是不断进行ATP/ADP的再循环，其相互转变的量十分可观，转变过程中伴随自由能的释放和获得，完成不同生命过程间能量的穿梭转换，因此称为“能量货币”。（三）ATP通过转移自身基团提供能量因为ATP分子中的高能磷酸键水解释放能量多，易释放Pi , PPi基团，很多酶促反应由ATP通过共价键与底物或酶分子

41、相连，将ATP分子中的Pi, PPi或者AMP基团转移到底物或酶蛋白上而形成中间产物，经过化学转变后再将这些基团水解而形成终产物。因此，ATP通过共价键参与酶促反应并提供能量，而不仅仅是单纯的水解反应。另外，ATP也能通过这种基团转移的方式，将能量有效地转移给底物分子，使其获得更多的自由能，有利于进行后续的反应。例如，ATP给葡萄糖提供磷酸基和能量，合成的葡糖一6磷酸容易进入糖酵解或其他代谢途径（四）磷酸肌酸是高能键能量的储存形式ATP充足时，通过转移末端一P给肌酸，生成磷酸肌酸（creative phosphate, CP），储存于需能较多的骨骼肌、心肌和脑组织中。当迅速消耗ATP时，磷酸肌

42、酸可将一P转移给ADP，生成ATP,补充ATP的不足（图8-14)。另外，磷酸烯醇式丙酮酸,1,3一二磷酸甘油酸等高能化合物中的磷酸基也易转移给ADP，迅速合成ATP。所以，ATP在体内能量捕获、转移、储存和利用过程中处于中心位置（图8-15）。188 第二篇 物质代谢及其调节第三节 氧化磷酸化的影响因素一、体内能量状态可调节氧化磷酸化速率氧化磷酸化是机体合成能量载体ATP的最主要的途径，因此机体根据能量需求调节氧化磷酸化速率，从而调节ATP的生成量。电子的氧化和ADP的磷酸化是氧化磷酸化的根本，通常线粒体中氧的消耗量是被严格调控的，其消耗量取决于ADP的含量，因此，ADP是调节机体氧化磷酸化

43、速率的主要因素，只有底物ADP和Pi充足时电子传递的速率和耗氧量才会提高。细胞内ADP的浓度以及ATP/ADP的比值能够迅速感应机体能量状态的变化。当机体蛋白质合成等耗能代谢途径活跃时，对能量的需求大为增加，ATP分解为ADP和Pi的速率增加，使ATP/ADP的比值降低、ADP的浓度增加，ADP进人线粒体后迅速用于磷酸化，氧化磷酸化随之加速，合成的ATP用于满足需求，直到ATP/ADP的比值回升至正常水平后，氧化磷酸化速率也随之放缓。通过这种方式使ATP的合成速率适应机体的生理需要。另外，ATP和ADP的相对浓度也同时调节柠檬酸循环、糖醉解代谢途径，满足氧化磷酸化对还原当量的需求。ADP的浓度

44、较低时，氧化磷酸化速率降低，也同时通过别构调节的方式抑制糖酵解、降低柠檬酸循环的速率，协调调节产能的相关途径。二、抑制剂可阻断氧化磷酸化过程（一）呼吸链抑制剂阻断电子传递过程此类抑制剂能在特异部位阻断氧化呼吸链中的电子传递。例如，鱼藤酮( rotenone )、粉蝶霉素A (piericidin A )及异戊巴比妥(amobarbital )等可阻断复合体I中从铁硫中心到泛醌的电子传递。萎锈灵（carboxin)是复合体的抑制剂。抗霉素A（antimycin A）阻断Cyt b H到泛醌（QN）间电子传递，黏噻唑菌醇则作用于QP位点，都是复合体的抑制剂。CN-,N3一可紧密结合复合体中氧化型C

45、yt a3，阻断电子由Cyt a到Cu B-Cyt a3间传递。CO与还原型Cyt a3结合，阻断电子传递给O2 。目前发生的城市火灾事故中，由于装饰材料中的N和C经高温可形成HCN，因此伤员除因燃烧不完全造成CO中毒外，还存在CN一中毒。此类抑制剂可使细胞内呼吸停止，与此相关的细胞生命活动停止，迅速引起死亡（图8-11）。（二）解偶联剂阻断ADP的磷酸化过程解偶联剂（uncoupler）可使氧化与磷酸化的偶联脱离，电子可沿呼吸链正常传递并建立跨内膜的质子电化学梯度储存能量，但不能使ADP磷酸化合成ATP。作用的基本机制是使质子不经过ATP合酶回流至基质来驱动ATP的合成，而是经过其他途径进入

46、基质，因而ATP的生成受到抑制。如二硝基苯酚（dinitrophenol, DNP )为脂溶性物质，在线粒体内膜中可自由移动，进人基质时释出H+，返回膜间腔侧时结合H+，从而破坏了质子的电化学梯度。机体也存在内源性的解偶联剂能使组织产热，如人（尤其是新生儿）、哺乳类动物中存在棕色脂肪组织，该组织中含有大量的线粒体，因而细胞色素蛋白明显增多，大量血红素的强吸光能力而使其带有颜色。棕色脂肪组织的线粒体内膜中存在一种特别的蛋白，称解偶联蛋白（un-coupling protein, UCPl），含量丰富。它是由2个32kDa亚基组成的二聚体，在线粒体内膜上形成质子通道，内膜膜间腔侧的H可经此通道返回

47、线粒体基质，使氧化磷酸化解偶联不生成ATP，质子梯度储存的能量以热能形式释放，因此棕色脂肪组织是产热御寒组织。新生儿硬肿症是因为缺乏棕色脂肪组织，不能维持正常体温而使皮下脂肪凝固所致。现已发现在骨骼肌等组织的线粒体中存在UCPl的同源蛋白UCP2,UCP3，但无解偶联作用，它们在禁食条件下表达增加，可能有其他的功能。体内游离脂肪酸也可促进质子经解偶联蛋白回流至线粒体基质中。第八章 生物氧化 189（三）ATP合酶抑制剂同时抑制电子传递和ATP的生成这类抑制剂对电子传递及ADP磷酸化均有抑制作用。例如寡霉素（oligomycin）可结合 Fo单位，二环己基碳二亚胺（dicyclohexyl ca

48、rlodiimide.;DCCP)共价结合Fo的c亚基谷氨酸残基，二者均阻断质子从F0质子半通道回流，抑制ATP合酶活性。由于线粒体内膜两侧质子电化学梯度增高影响呼吸链质子泵的功能，继而抑制电子传递。各种抑制剂对离体线粒体耗氧的影响见图8-16。三、甲状腺激素可促进氧化磷酸化和产热机体的甲状腺激素诱导细胞膜上Na，K+-ATP酶的生成，使ATP加速分解为ADP和Pi，ADP增多促进氧化磷酸化。而且甲状腺激素（T3）可诱导解偶联蛋白基因表达，引起物质氧化释能和产热比率均增加，ATP合成减少，导致机体耗氧量和产热同时增加，所以甲状腺功能亢进症患者基础代谢率增高。四、线粒体DNA突变可影响氧化磷酸化

49、功能线粒体DNA(mtDNA）呈裸露的环状双螺旋结构，缺乏蛋白质保护和损伤修复系统，容易受到损伤而发生突变，其突变率远高于核内的基因组DNA,线粒体DNA包含37个基因，用于表达呼吸链复合体中13个亚基以及线粒体内22个tRNA和2个rRNA。复合体I中的7个亚基、复合体中的1个亚基、复合体中的3个亚基以及ATP合酶的2个亚基均由mtDNA表达产生。因此mtDNA突变可直接影响电子的传递过程或ADP的磷酸化，使ATP生成减少而致能量代谢紊乱，进而引起疾病。mtDNA突变部位、突变的程度和各器官对ATP的需求不同，会产生不同的疾病，但功能障碍首先出现在耗能较多的组织，如脑组织。随着年龄的增长，如

50、果mtDNA突变严重累积，可导致帕金森病、老年性痴呆症等退行性疾病的发生。遗传性mtDNA疾病以母系遗传居多，因每个卵细胞中有几十万个mtDNA分子，每个精子中只有几百个mtDNA分子，受精卵mtDNA主要来自卵细胞，因此，卵细胞mtDNA突变对疾病的发生影响较大。190 第二篇 物质代谢及其调节五、线粒体的内膜选择性协调转运氧化磷酸化相关代谢物线粒体基质与胞质之间有线粒体内、外膜相隔，外膜对物质的通透性高、选择性低，线粒体内膜含有与代谢物转运相关的转运蛋白体系，对各种物质进行选择性转运，维持组分间的平衡，以保证生物氧化和基质内旺盛的物质代谢过程能够顺利进行（表8-4）。（一）饱质中的NADH

51、通过穿梭机制进入线粒体的氧化呼吸链生物氧化的脱氢反应可发生在细胞的胞质或线粒体基质中，在线粒体内生成的NADH可直接进人氧化呼吸链进行电子传递。但NADH不能自由穿过线粒体内膜，在胞质中经糖酵解等生成的NADH需通过穿梭机制进人线粒体的呼吸链才能进行氧化。1. a-磷酸甘油穿梭主要存在于脑和骨骼肌中 如图8-17所示，胞质中的NADH+H在磷酸甘油脱氢酶催化下，将2H传递给磷酸二经丙酮，使其还原成a一磷酸甘油，后者通过线粒体外膜，到达线粒体内膜的膜间腔侧。在线粒体内膜的膜间腔侧结合着磷酸甘油脱氢酶的同工酶，此酶含FAD辅基，接受一磷酸甘油的还原当量生成FADH2和磷酸二经丙酮。FADH2直接将

52、2H传递给泛醌进人氧化呼吸链（图8-17）。需要指出的是，此机制是FADH2将NADH携带的一对电子从内膜的膜间腔侧直接传递给泛酿进行氧化磷酸化，因此，1分子的NADH经此穿梭能产生15分子ATP.第八章 生物氧化 1912.苹果酸一天冬氮酸穿梭主要存在于肝和心肌中 该穿梭在肝、肾及心肌细胞中极为活跃，涉及2种内膜转运蛋白和2种酶协同参与。胞质中的NADH+H+使草酞乙酸还原生成苹果酸，苹果酸经过线粒体内膜上的苹果酸一一酮戊二酸转运蛋白进人线粒体基质后重新生成草酞乙酸和NADH+H。基质中的草酞乙酸转变为天冬氨酸后经线粒体内膜上的天冬氨酸谷氨酸转运蛋白重新回到胞质，进人基质的NADH+H则通过

53、NADH氧化呼吸链进行氧化，并产生2.5分子ATP（图8-18）。两种穿梭进人呼吸链方式不同，使胞质中NADH+H十生成不同量的ATP分子。（二）ATP-ADP转位酶协调转运ADP进入和ATP移出线粒体电子传递产生的跨膜质子梯度主要用于驱动ATP的合成，同时也驱动内膜上的转运蛋白用于转运氧化磷酸化的相关组分，包括腺苷酸转运蛋白、磷酸盐转运蛋白。腺苷酸转运蛋白即为ATP-ADP转位酶（ATP-ADP translocase )，又称腺苷酸移位酶，富含于线粒体内膜，可占内膜蛋白总量的14%。它是由2个30kDa的亚基组成的二聚体，形成跨膜蛋白通道，将膜间腔的ADP3-（在细胞pH中,ADP呈解离状

54、态）转运至线粒体基质中，同时从基质转运出ATP4-，使经内膜的ADP3-进人和ATP4-移出紧密偶联，维持线粒体内外腺昔酸水平基本平衡。每分子ATP4-和ADP3-反向转运时，实际向膜间腔净转移1个负电荷，而膜间腔的高正电性有利于ATP的泵出。此时，跨膜质子梯度的能量也驱动膜间腔的H+和H2PO42-经磷酸盐转运蛋白同向转运到线粒体基质中（图8-19）。因此每分子ATP在线粒体基质中生成并转运到胞质共需4个H+回流进人线粒体基质中。心肌和骨骼肌等耗能多的组织中线粒体膜间腔中存在一种肌酸激酶同工酶，它催化经ATP-ADP转位酶运到膜间腔中的ATP与肌酸之间一P转移，生成的磷酸肌酸经线粒体外膜中的

55、孔蛋白进人胞质中，在细胞需能部位由相应的肌酸激酶同工酶催化，将一P转移给ADP生成ATP，供细胞利用。因此，线粒体内膜的选择性协调转运，对于氧化磷酸化的正常运转至关重要。192 第二篇 物质代谢及其调节第四节 其他氧化与抗氧化体系一、线粒体氧化呼吸链也可产生活性氧O2得到单个电子产生超氧阴离子（O2-），超氧阴离子部分再接受单个电子还原生成过氧化氢H2O2 ，H2O2可再接受单个电子还原生成经自由基(-OH).这些未被完全还原的氧分子，其氧化性远大于O2，合称为反应活性氧类（reactive oxygen species，ROS)。线粒体的呼吸链是机体产生ROS的主要部位，呼吸链的各复合体在传

56、递电子的过程，由于将漏出的电子直接交给氧，产生部分被还原的氧，所以得到R璐这样的“副产物”，特别是飞的产生主要源自呼吸链。复合体uI中通过Q循环传递电子，接受单电子的半酪型泛醒QH在内膜中自由移动，通过非酶促反应直接将单个电子泄漏给02而生成认。呼吸链末端的细胞色素氧化酶从金属离子每次转移1个电子、通过4步单电子转移将氧彻底还原生成水，也会有少量氧接受单电子或双电子被部分还原而生成O2-和H202 。而且产生的伏在线粒体中可再接受电子转变为H2O2和OH。除呼吸链外，胞质中的黄嚓吟氧化酶、微粒体中的细胞色素P450氧化还原酶等催化的反应，需要氧为底物，也可产生O三。细胞过氧化酶体中，FAD将从

57、脂肪酸等底物获得的电子交给认可生成H2 02和经自由基OH.但这些酶产生的ROS远低于线粒体呼吸链。另外，细菌感染、组织缺氧等病理过程，电离辐射、吸烟、药物等外源因素也可导致细胞产生大量的活性氧类。呼吸链产生的仇等活性氧分子可通过不同方式释放到线粒体基质、内膜外的胞质侧以及细胞胞质中，对细胞的功能产生广泛的影响。活性氧类化学性质非常活泼，氧化性强，其中经自由基的氧化活性最强。O2-可迅速氧化一氧化氮（NO）产生过氧亚硝酸盐（ONO-，也属于ROS），后者能使脂质氧化、蛋白质硝基化而损伤第八章 生物氧化 193细胞膜和膜蛋白。经自由基等可直接引起蛋白质、核酸等各种生物分子的氧化损伤而丧失功能，进而破坏细胞的正常结构和功能。线粒体是细胞产生ROS的主要部位，因此线粒体DNA,基质中代谢途径的酶等最容易受其攻击而损伤或突变，对能量代谢旺盛的组织如脑、心肌、肝、肾等影响极大，导致疾病、衰老。如线粒体基质中的顺乌头酸酶，其铁硫中心易被0三氧化而丧失功能，直接影响柠檬酸循环的功能。线粒体一方面通过消耗氧用于合成ATP供能，另一方面也会产生活性氧类而损伤自身及细胞等。生物进化已使机体发展了有效的抗氧化体系及时清除活性氧，防止其累积造成有害影响。二、抗氧化酶体系有清除反应活性氧的功能正常机体存在的各种抗氧化酶、小分子抗氧化剂等，形成了重要的防御体系以对抗活性氧的损害。广泛分布的超氧化物歧化