鼠疫实验室检测技术

1、鼠疫实验室检测技术、鼠疫实验室检测、生长繁殖检测、病原体本身的生理生化特性：鼠疫耶尔森菌染色检查；鼠疫耶尔森菌培养和鼠疫噬菌体试验；鼠疫耶尔森菌的生化检验、营养要求、毒素检测和毒力测定。病原体特异性抗原结构检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫耶尔森菌外膜蛋白的检测。病原体基因检测：鼠疫耶尔森菌质粒检测；鼠疫耶尔森菌特异性核酸片段的检测；鼠疫耶尔森菌的基因组测定；插入序列的检测。1.鼠疫耶尔森氏菌的形态学检查表明，典型的鼠疫耶尔森氏菌短而粗，长12米，宽0.50.7米，中段膨大，两端呈圆形，卵圆形菌囊密集，无鞭毛，无孢子。革兰氏染色阴性。典型的鼠疫耶尔森氏菌具有钝端和密集的两极，可以在感染动物或病人

2、的新鲜器官及其尸体上的印记中看到。印迹标本的吞噬细胞内外均可见鼠疫耶尔森氏菌，这对鉴别杂菌污染的物质具有重要价值。鼠疫耶尔森菌染色方法包括革兰氏染色(细菌被染成红色)、美兰染色(细菌被染成蓝色，两极被严重染色)、姬姆萨染色(细菌被染成彩色，荚膜被染成彩色)、鼠疫耶尔森菌染色检查(器官印记)、美兰染色、革兰氏染色、鼠疫耶尔森菌染色、鼠疫耶尔森菌涂片革兰氏染色、鼠疫耶尔森菌染色检查和韦森染色。鼠疫耶尔森氏菌既是需氧的又是兼性厌氧的。鼠疫耶尔森菌在普通培养基上生长良好，最适培养温度为28，最适酸碱度为6.9-7.1，发育初期最适氧化还原电位约为100150毫伏。肉眼可见的菌落可在接种后至少20小时形

3、成，肉眼可见的小菌落通常可在2448小时形成。致命的鼠疫耶尔森氏菌半依赖钙离子，当它缺乏时生长不良。在缺钙条件下，强毒鼠疫耶尔森氏菌生长受限，并释放出大量的Yops，表现出强毒蛋白V抗原(LcrV)的强烈表达和分泌。这种现象被称为低钙血症反应，由70kb(45MD)质粒上的基因控制。在光学显微镜下，将典型的鼠疫耶尔森菌在透明的碎玻璃片中培养18-20小时。培养超过24小时的菌落在透射光下为浅灰白色，略带淡青色，菌落的圆形凸起在反射光下为浅灰白色。显微镜下，菌落的中心是黑色的，带有棕色的粗糙颗粒，周围是一个不同宽度和边缘的圆圈，带有锯齿状的薄而透明的花边。鼠疫耶尔森氏菌噬菌体试验，鼠疫耶尔森氏菌

4、在培养基上密集平行划线培养，鼠疫耶尔森氏菌噬菌体在上部划线的中间落下，平板竖起，使噬菌体液在垂直划线后自然流下，培养20小时，有明显的吞噬带。1822年，鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫耶尔森氏菌，而不能裂解假结核杆菌，这是鼠疫细菌学诊断中的特异性鉴定方法之一。鼠疫噬菌体试验可以快速诊断鼠疫耶尔森菌。在细菌分离培养的同时进行噬菌体裂解试验，结果可在20小时左右获得。鼠疫耶尔森氏菌可通过分离鼠疫耶尔森氏菌噬菌体间接确定。鼠疫耶尔森菌培养和噬菌体试验，典型鼠疫耶尔森菌菌落形态，吞噬带，鼠疫耶尔森菌培养和噬菌体试验，鼠疫耶尔森菌培养特征，鼠疫耶尔森菌噬菌体试验，3。鼠疫F1抗原和抗体的检测，鼠疫F1抗原1的检

5、测。反向血凝试验(RIHA) 2。酶联免疫吸附试验。胶体金免疫层析(GICA) 4。免疫荧光技术检测鼠疫耶尔森菌F1抗体1。间接血凝试验(IHA) 2。酶联免疫吸附试验。胶体金免疫层析(GICA)和间接血凝试验(IHA)。鼠疫耶尔森菌特异性F1抗原致敏的绵羊红细胞用鞣酸鞣制制备F1抗原致敏的血细胞。测试方法和结果判断是常规操作。IHA微量分析结果：反向血凝试验(RIHA)，用F1抗体致敏血细胞，并检测鼠疫特异性F1抗原RIHA微量分析结果：酶联免疫吸附试验，抗体检测。双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，加入待测标本28，洗板1.5h，加入HRP-F1抗原28，洗板1h，加入底物OPD，避光30分

6、钟，然后加入终止液(2mol硫酸)。间接法：用已知的F1抗原包被反应板，加入样品37洗涤1小时，加入酶标二抗37洗涤1小时，加入底物(如OPD或TMB)避光反应30分钟，然后加入终止液。用肉眼观察结果，用微孔板读取器检测每个孔的吸光度值(a)。抗原检测的夹心法如下：F1-单克隆抗体包被反应板，加入样品28反应1.5h，加入辣根过氧化物酶-F1-单克隆抗体28反应1h，加入底物OPD屏蔽反应30分钟，然后加入终止液。双抗体夹心法(CDC鼠疫诊断技术实验室改进方法-操作手册):将鼠疫免疫血清特异性抗体(F1Ab)包被在反应板上，加入样品37反应1小时，加入小鼠F1单克隆抗体溶液37静置1小时，洗板

7、，加入HRP标记的绵羊抗鼠IgG 37反应1小时，洗板，加入底物OPD显色反应30分钟，加入终止液。用肉眼观察结果，并用微孔板读数器检测每个孔的吸光度值。胶体金免疫层析法(GICA)和检测鼠疫耶尔森菌特异性抗原和抗体的金标准技术在实践中得到广泛应用。基本原理是三明治法。双抗体夹心法检测抗原：另一种单克隆抗体(金标记-F1单克隆抗体)用金标记待测抗原(F1Ag)，在单克隆抗体(F1单克隆抗体)样品上固定于硝酸纤维素膜上显色。双抗原夹心法抗体检测：鼠疫F1抗原(F1Ag)标本中待测抗体的F1抗原(金标记-F1Ag)固定在硝酸纤维素膜上显色。夹心法抗体检测：将鼠疫F1抗原标本中相应的抗体金标记固定在

8、膜上进行SPA染色。采用GICA双抗体夹心法检测抗原。g区：金标特异性抗体(小鼠F1单克隆抗体)、C区：山羊抗小鼠Ig、T区：特异性单克隆抗体(F1单克隆抗体)、吸水纸、标本、免疫荧光技术(IFT)、荧光素(如异硫氰酸荧光素FITC)用于检测抗体。使用FITC-菲姆卡(0.2毫升)进行荧光染色，在室温下反应30分钟，然后用自来水冲洗。干燥后，鼠疫杆菌用翠绿色荧光染色，鼠疫杆菌用荧光染色，抗体阳性被视为明亮，细菌细胞周围的绿色染色强度。用于检测鼠疫耶尔森氏菌特异性基因片段的聚合酶链反应，靶基因：鼠疫耶尔森氏菌的fra和pla特异性基因片段的引物序列和扩增产物的长度靶基因引物序列产物长度fra 1

9、 F5-ggaaccactacacatctgtt-3 249 bp1r 5-acctgctgcaagtttaccgcc-3p ala2 F5-actcgaccaggatgaatgaac Atc-3 456 BP 2r 5-gtgacatatccacgtatat-3内部对照：使用鼠疫耶尔森氏菌EV菌株的DNA16SrRNA基因引物：F5-agcggcggaagtagtt-3r 5-tcaaccccttctcgct-3用于扩增16SrRNA基因的396bp片段，该片段与载体重组。产品长度为645 bp，内部控制用于有效防止假阴性结果。采用多重聚合酶链反应方法检测鼠疫耶尔森菌，选择的扩增区域均为鼠疫

10、耶尔森菌的特异性区域，可有效区分鼠疫耶尔森菌和其他高特异性细菌。鼠疫聚合酶链反应系统，聚合酶链反应系统(总量：25l)，当使用其他总量时，下列公式按比例改变。无菌去离子水13.5升10反应缓冲液2.5升4dNTP混合物(每个2.5毫米)2升引物(1F，1R，2F，2R) 1l内部控制模板(IC) 1l待测样品1l Taq DNA聚合酶1l，鼠疫聚合酶链反应，反应条件(扩增):预变性95分钟，1个周期；然后951分钟，551分钟，721分钟，30个循环；最后72 5分钟。总共1小时40分钟。电泳：向反应管中加入5l溴酚蓝指示剂，混合并短暂离心。将8l上述处理过的反应产物加入到胶体的每个孔中，在三

11、丁基锡化合物缓冲液中进行电泳多重聚合酶链反应扩增结果，鼠疫内对照质粒和不同浓度的EV菌，鼠疫多重聚合酶链反应扩增结果，鼠疫菌质粒检测，鼠疫菌的三种常见质粒：pPCP1 6Mda(9.5kb)编码鼠疫耶尔森菌，鼠疫耶尔森菌耐受性，凝固酶和细胞分裂素激活因子；PCD145 Mda(70kb)编码分泌系统质粒，主要编码低钙反应，表达LrcV和一系列Yops耶尔森氏菌特有的；PMT1 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。91001新发现的质粒pCRY长度为21742bp，具有独立复制的能力，并具有一组编码分泌系统的基因。质粒DNA提取-质粒电泳分析通过碱裂解和热裂解，鼠疫耶尔森菌的研究进展，传统的病原体分类和鉴定方法：形态学特征，生长特征(培养特征)，血清学反应，生化特征，基因分类和鉴定方法：大多基于聚合酶链反应和核酸凝胶电泳技术， 通过电泳图谱的比较分析揭示基因组成的差异