HBV、HCV检测规程

1、乙型肝炎病毒核酸定量检测1 原理本试剂盒用一对乙型肝炎病毒特异性引物和一条乙型肝炎病毒特异性荧光探针配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（TAQ酶）、核苷酸单体（DNTPS）等成分，用PCR体外扩增法定量检测乙型肝炎病毒DNA。2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.1.1标本种类：血清或血浆。2.1.2标本要求：血清用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000rpm离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。血浆用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合510次，使抗凝

2、剂与静脉血充分混匀，3000rpm离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与20待测，保存期为6个月。2.3标本运输：密封，室温运输。2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。3 试剂3.1 试剂名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。3.3 包装规格：20人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，DNA提取液，PCR反应管，HBV临界阳性质控品，HBV强阳性质控品，阴性质控品，HBV阳性定量参考品（1.0104IU/ml、1.010

3、5 IU/ml、3.5试剂储存条件及有效期：-20避光保存，有效期6个月。4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(级)、高速冷冻离心机、荧光定量PCR仪、恒温金属浴。4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。 4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。5 操作步骤5.1 DNA提取：5.1.1 标本处理（血清和血浆标本处理相同）-取100ul血清加入等量DNA浓缩液，振荡器振荡混匀5sec；12，000rpm离心10min；去上清，沉淀中加入30ul DNA提取液，振荡器剧烈振荡混匀5-10sec，瞬时离心数秒

4、，100恒温处理101min；12，000rpm离心5min，备用。5.1.2 阴性质控品处理-取出阴性质控品，8，000rpm离心数秒，吸50 ul至0.5ml灭菌离心管中，加入50 ul DNA提取液充分混匀，100恒温处理101min：12，000rpm离心5min，备用。5.1.3 HBV临界阳性质控品处理（同阴性质控品）5.1.4 HBV强阳性质控品处理（同阴性质控品）5.1.5 HBV阳性定量参考品处理：振荡摇匀，8，000rpm离心数秒，备用。5.2 PCR扩增5.2.1 加样： 取PCR反应管若干，分别加入处理后的样品（包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品）上清液2 ul或直接

5、加入阳性定量参考品2UL，8，000rpm离心数秒，放入仪器样品槽。5.2.2 扩增：打开instrument窗口设置循环条件： 93 2min93 45sec55 60sec10个循环， 93 30sec55 45sec30个循环，保存文件，运行。6 结果判断与分析6.1如果增长曲线不呈S型曲线或ct值=30，则判样品的HBV DNA总含量小于检测下限。6.2如果增长曲线呈S型曲线且ct值30，则按以下方法判断：若定量数值在线性范围内：1.00E+003 C1.00E+008，则样品HBV DNA总含量为 C IU/ml；如果定量数值在线性范围外：有两种情况: 6.2.1 C1.00E+00

6、8, 则样品HBV DNA总含量1.0108 IU/ml.如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内再检测。6.2.2 C1.00E+003, 则样品的HBV DNA总量为C IU/ml，定量数值供参考。7 质量控制根据实验结果表中显示的Ct值来判断实验是否成功：如试剂质量完好并操作正确，阳性对照应表现为阳性结果，阴性对照应无Ct值，否则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。定量阳性对照应能形成标准曲线，相关系数在0.99以上，则证明实验成功； 8 参考范围：1000IU/ml。9 操作性能：根据临床考核，本试剂盒的检测下限为5.0102 IU/ml，线性范围为1.01

7、03-1.0108IU/ml。10 临床意义：PCR定量结果用于与血清基因学结果的综合评价及观察抗病毒药物对慢性乙型肝炎治疗效果，指导药物用量；进行献血员窗口期病毒核酸的筛查及早期诊断；跟踪观测肝移植术后的HBV复发情况，及进行对阻断母婴传播的监测。11 方法局限性: 对于结果阳性的报告，只表明该样本中有病毒的遗传物质DNA存在，并不表明有活病毒存在;虽然本试剂盒检测特异性、灵敏度均高，但检测结果为阴性的并不能排除样本含有病毒，只能说明样本中含有的病毒浓度低于本试剂盒的检测灵敏度。12 注意事项12.1开始检测前请仔细阅读本说明书全文。12.2 若血清标本出现溶血现象，则认为标本不合格，建议重

8、新采集标本。12.3 每次实验前、后按照用1次氯酸钠、蒸馏水、75酒精的顺序进行消毒清洁擦拭移液器、操作台。并用紫外消毒灯照射工作台面。12.4 在试剂准备和样本处理时应使用防污染罩。操作戴口罩、一次性手套。12.5 在实验中使用带滤芯的移液器头并且所用器具均应经过灭菌处理。12.6 每次实验应设置阴阳性对照品；在有效期内使用试剂盒。12.7 试剂盒组成中离心管使用前应充分融化并混匀。12.8 DNA提取液使用前，需充分融化后混匀。12.9 反应管中加人DNA模板后，应尽快完成荧光测定，开始PCR反应。12.10 配制反应体系过程中若需标记，请在试管架或离心管架上标记，不要直接标记在离心管上。

9、12.11检测后遗留的血清样本或痰样本应立即盖好盖子置于样品处理区的垃圾桶内；检测中所有用过的手套应扔在本工作区的垃圾桶内，不得带出该工作区。12.12 各工作区垃圾桶内的垃圾均作为有生物传染性的危险品每天由专人处理。13 参考文献卫生部微生物生物医学实验室生物安全通用准则和医疗废物管理条例。丙型肝炎病毒核酸定量检测操作规程1 原理本试剂盒用一对丙型肝炎病毒特异性引物和一条丙型肝炎病毒特异性荧光探针，配以PCR反应液、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、核苷酸单体（dNTPs）等成分，用PCR体外扩增法，通过荧光信号的变化，经过逆转录检测丙型肝炎病毒RNA。2 标本种类及收集要求2.1 标本采集2.

10、1.1标本种类：血清或血浆。2.1.2标本要求：血清用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入无菌的干燥生化管，使用水平离心机，3000RPM离心10min;吸取上层血清，转移至1.5ML进口灭菌管。血浆用一次性无菌采血针抽取受检者静脉血2ml，注入含EDTA（乙二胺四乙酸二钠）抗凝剂管，立即轻轻颠倒玻璃管混合510次，使抗凝剂与静脉血充分混匀，3000RPM离心10min;吸取上层血浆，转移至1.5ML进口灭菌管2.2 标本储存：标本可立即用于测试，也可以保存与20待测，保存期为6个月。2.3标本运输：密封，室温运输。2.4标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测

11、。3 试剂3.1 试剂名称：丙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）3.2 试剂生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司。3.3 包装规格：10人份/盒3.4 试剂盒组成DNA浓缩液，RNA提取液A，RNA提取液B,HCV PCR反应液I,逆转录酶，DEPC H2O ,PCR反应管，HCV临界阳性质控品，HCV强阳性质控品，阴性质控品，HCV阳性定量参考品（1.0105IU/ml、1.0106IU/ml、1.0107 IU/ml、1.0108 IU/ml）。3.5试剂储存条件及有效期：-20避光保存，有效期6个月。4 仪器设备4.1 仪器名称：生物安全柜(级)、高速冷冻离心机、荧光定

12、量PCR仪、恒温金属浴。4.2 仪器厂家：上海培清、美国NUAIR公司、美国eppendorf、美国ABI生物技术公司、广州达安基因有限公司。 4.3 仪器型号：ABI7300、DA7600。5 操作步骤5.1 RNA提取5.1.1 标本及质控品处理5.1.1.1取灭菌的1.5mlEP离心管加入10ul RNA提取液A（充分混匀后吸取），加100 ul血清标本（吸取血清时注意勿带入红细胞）或阴阳性质控品，再加入200 ul RNA提取液B （RNA提取液B溶解混匀后使用），振荡混匀，室温放置5min，8.000rpm离心1min，小心吸去上清（注意吸头不要碰到沉淀）；5.1.1.2 加200u

13、l RNA提取液B，充分混匀（用移液器吹打），8.000rpm离心1min，小心吸去上清；5.1.1.3 加预冷的75%乙醇（用无水乙醇和试剂盒提供的DEPC H2O配置）450 ul充分混匀，8.000rpm离心1min，小心吸去上清； 5.1.1.4加预冷的75%乙醇450 ul充分混匀，8.000rpm离心1min，小心吸去上清；5.1.1.5 打开管盖，70干燥10min（75%乙醇要全部挥发完毕），盖上管盖待用于逆转录。5.1.1.6 HCV阳性定量参考品处理：8，000rpm离心数sec，备用5.2 逆转录5.2.1 向干燥后的沉淀管加入18ul PCR反应液I打匀，再加逆转录酶系

14、2ul，振荡混匀：37放置45min，95加热3min。8000rpm离心1min，待用（逆转录成cDNA后，建议马上进行下一步实验，否则请转移上清至灭菌离心管，保存于-20待用）。5.3 PCR扩增5.3.1 加样：取PCR 反应管若干，加入逆转录后的样品（包括标本、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品）上清液5ul，或直接加入阳性定量参考品5ul，8000rpm 离心数sec，放入仪器样品槽。5.3.2 打开instrument 窗口设置循环条件：93 2min93 45sec55 60sec10个循环，93 30sec55 45sec30个循环6 结果判断与分析6.1 如果增长曲线不

15、呈S 型曲线或ct值=30 ，则判样品的HCV RNA 总含量小于检测极限。6.2 如果增长曲线呈S 型曲线或ct值30，则按以下方法判断 ：若样品的C1.00E+003,则判样品HCV DNA总含量1.0103 Iu/ml若样品的1.000E+003C1.000E+08，则判样品HCV DNA总含量=C IU/ML若样品的C1.000E+08 ，则判样品HCV DNA总含量1.0108 IU/ml。如果需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至线性范围内在检测。7 质量控制阴性质控品：增长的曲线不呈S 型曲线或ct值=30；阳性质控品：增长曲线呈S 型曲线。且强阳性质控品定量参考值在5.010

16、6 IU/m5.0108 Iu/ml范围 ，临界阳性质控品定量参考值在2.0103 IU/ml5.0105IU/ml 范围；阳性定量参考品：增长曲线呈S 型曲线，ct值27，且0.97 r1；8 参考范围：1000IU/ml。9 操作性能：根据临床考核，本试剂盒对处理后样品的灵敏度为1.0103IUml ， 线性范围为1.01031.0108IU/ml。10 临床意义：检测血清HCV-RNA已成为诊断HCV病毒血症的“金标准”。有利于病症的早期诊断、鉴别诊断，同时可为临床的用药剂量、时间等提供依据。11 方法局限性: 对于结果阳性的报告，只表明该样本中有病毒的遗传物质DNA存在，并不表明有活病毒存在;虽然本试剂盒检测特异性、灵敏度均高，但检测结果为阴性的并不能排除样本含有病毒，只能说明样本中含有的病毒浓度低于本试剂盒的检测灵敏度。12 注意事项12.1实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训，实验过程严格分区进