第三章抗生素发酵生产工艺

1、1、第十一章抗生素发酵生产技术，讲师：生科院洪军，2，制药微生物生产菌种如何选育？发酵中主要检测出的残奥表是什么？ 发酵过程是如何控制的？ 知识回顾，3，主要内容，抗生素概述：(1)抗生素的定义(2)抗生素的命名(3)抗生素分类青霉素的发酵生产技术： (重点) (1)青霉素的概述(2)生产菌的生物科学特性(2)因此，抗生素(antibiotics )是微生物在代谢过程中浓度低由于抗生素的这种杀菌能力，我们曾经称这种物质为抗生素。 5、目前：源：随着抗生素的研究和生产的发展，新的抗生素源不断扩大。 微生物、植物(例如，大蒜素、常山盐化学基、黄连素、长春花盐化学基、鱼腥草素等)、动物(例如，鱼素、

2、血红细胞素等)。 然而，抗生素的工业化生产主要是来自微生物的大量发酵法，微生物是抗生素舞台上的主角。 作用对象：细小病毒、细菌、真菌、原生动物、寄生虫、藻类、肿瘤细胞球等。 抗生素不能作为抗微生物剂使用。 6、定义：抗生素使用广泛，但由于抗生素的多样性，对抗生素的定义在专门人才中一直存在分歧。 目前，大多数专门人才所接受的定义是，抗生素是在生物(包括某些微生物、植物、动物)的生命活动过程中产生的，或者是(由化学合成得到的)低浓度、能选择性抑制其他生物功能的低分子量有机物。 狭义的定义是，抗生素是低分子量的微生物代谢产物，低浓度能抑制其他微生物的生长。 7、按生物来源：动物、植物、微生物所产生的

3、，可按来源命名。 如青霉素、赤霉素、大蒜素由化学结构命名：化学结构性质清晰，如抗四环素(包括并四苯的基本母核)、氯抗四环素(多氧注音字素)、氧抗四环素(赤霉素)。 其他：纪念意义、产地、俗名，如正定霉菌、井冈霉菌、毒注音字素和赤霉素等。 (2)抗生素命名(一般分为三种)，8、北环(natural penicillin R=、CH2-CO-、9、-内酰胺环、苯并异恶唑啉、氨基苯偶酰青霉素1958年6月3日，最大的抗生素联合企业(华北制药厂、石家庄)完成生产现在原料药基地很多。 但是，在半合成及制品药的剂型方面与国外相比有很大差异。11、抗生素滥用的灾区，中国是抗生素使用大国，也是抗生素生产大国：

4、年产抗生素原料约21万吨，出口3万吨，其自用(包括医疗和农业使用)，人均年消费量138克左右(美国只有13克)。 2011年4月7日是世界卫生日，首次合理用药大会当天召开，正好符合世界卫生日的主题“耐药性：今天不采取行动，明天就没有药”。 12、“后抗生素时代”，如果不特罗尔整抗生素的滥用状态，二十一世纪的人类就有可能失去抗生素这一有利的治疗武器，再次回到没有抗生素的时代，即所谓的“后抗生素时代”。 后抗生素时代正在倒退，药物有可能回到不可用状态，大量的传染性疾病危害人类健康和生命。 这是悲观的思维方法，悲观是有道理的，细菌的耐药性远远快于新药物开发的速度，这是确实的现象。、13，3抗生素的分

5、类可以从生物来源、作用对象、化学结构、作用机制、生物合成路线等方面分类抗生素。 3.1抗生素的生物来源分类(生物学家) (1)放线菌产生的抗生素：例如链霉素、四环类(例如抗四环素)、宏命令内酯类(例如赤藓红)、聚乙烯管类(例如抑制霉菌素)、放线菌素类(例如放线菌素d )等。 (其中链霉菌属最多，去甲霉素属，孢霉素次) (2)真菌产生的抗生素：如青霉属和头孢菌素属等分别产生重要的抗生素(青霉素、红霉素、头孢菌素)。 (14 )细菌产生的抗生素：如多粘菌、纳豆菌、芽胞杆菌等。 例如，多粘菌。 (4)植物或动物产生的抗生素：从被子植物的大蒜中获得的大蒜素动物的器官制造的钓鱼式攻击等。 3.2根据抗生

6、素的作用对象进行分类(医生，病理学家) (1)广谱抗生素：如阿摩尼亚薄板青霉素抑制g、G- (2)抑制抗g的抗生素：如青霉素、(3)抗G-的抗生素：如链霉素(3)抗(5)抗癌抗生素：如阿维菌素3.3根据抗生素的化学结构分类(化学家)复杂、目前确定结构的抗生素习惯分为以下几类： (1)内酰胺类抗生素：包括青霉素类的头孢菌素类等；(2)氨基糖苷类抗生素：包括链霉素、庆大霉素等；(3) 大环内脂类抗生素：如红霉素、万古霉素(4)四环类抗生素：如抗四环素、赤霉素(5)多肽类抗生素：如多粘菌、多肽3.4作用机制分类该分类优点：易于进行理论研究，有助于理解抗生素影响病原体新陈代谢的环节(1)抑制细胞贴壁合

7、成的抗生素：青霉素等。 (2)影响胞质膜功能的抗生素：多烯类抗生素。 (3)抑制致病菌蛋白质合成的抗生素：抗四环素。 (4)抑制核酸合成的抗生素：如影响DNA结构和功能的丝裂霉素c。 (5)抑制生物能作用的抗生素：如抑制电子转移的抗霉素。 (1)根据氨基酸、肽类诱导体抗生素对17，18，3.5抗生素的合成路线分类低聚肽抗生素，如青霉素类、头孢菌素等。 (2)糖类诱导体抗生素：如链霉素等糖苷类抗生素。 (3)冰乙酸、丙酸单位的诱导体抗生素：红细胞吉卜赛人素等丙酸诱导体。 19、生产方法： 1、生物合成法：传统方法“工程菌”制造法细胞融合技术法2、化学合成法3、生物合成加化学合成法。 4抗生素生产

8、工艺，20，1，生物合成法：传统方法多来源于放线菌和霉菌。 菌种是从土壤中分离、筛选而得，采用深层换气搅拌发酵槽生产。 由于传统方法目前存在诸多不足，人们采用基因工程和细胞融合技术，改造、重新修订抗生素产生菌，不仅可以制造许多高效低毒的新型抗生素，而且可以改革技术，使抗生素产量加倍。 21、“工程菌”制造法首次从“工程菌”制造的新抗生素马迪视紫质a，在美国有报道。 他们将部分产生视紫质的基因插入产生麦迪逊的放线菌中，并通过建构得到的“工程菌”产生新的抗生素。 我国新建构的生产丁胺卡那霉素的“工程菌”，都是将酰化酶催化剂基因克隆复制到卡那霉素产生菌后得到的。 新“工程菌”生产的新抗生素毒副作用小

9、，对卡那霉素、庆大霉素致病菌的临床治疗效果显着。 22、细胞融合技术对抗生素产生菌采用细胞融合技术的效果更显着。橄榄色孢霉素细胞融合株的抗生素生产率比原菌株提高了140倍。 目前，DNA重组技术已广泛应用于赤霉素、链霉素等20多种抗生素的育种，近期将有更多的“工程菌”生产的新型抗生素问世。23、2、化学合成法可根据某些抗生素的化学组成和结构，采用化学合成的方法，生产部分抗生素。 例如，氯霉素、磷霉素等。 经过化学合成方法和控制条件的研究，越来越多的抗生素可以用化学合成法生产。 24，3，生物合成化学合成法的许多细菌逐渐出现药物耐受力，已证实某些耐药因子位于细菌内的质粒上，质粒可在细菌间转移，结

10、果导致药物耐受力越来越多，抗生素疗效越来越低。 为了应对细菌的药剂耐受力，科学家对传统的抗生素进行了“整形手术”，细菌由于无法识别经过修饰的抗生素而被抑制或杀害。 使用克隆复制了酰化酶催化剂基因的“工程菌”(大肠菌群)可以有效地生产半合成抗生素。 临床上使用的珍贵特效药物头孢菌素(头孢菌素类)、氨西林就是这种半合成抗生素类药物。 国外已有数十种此类药物在实验室研究开发成功。 25、抗生素制备的一般程序流程图、菌种孢子制备发酵液预处理及种子加滤提取及精制产品检验、发酵阶段、提取阶段、产品外包装、5青霉素概要、26、27、 易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯类化合物等一般有机溶剂。 游离酸和盐类

11、的水溶液都不稳定，容易失去抗菌效果。 不耐热，一般保存在冰箱中，青霉素盐的结晶纯品，在干燥条件下可以在室温下进行三年五载保存。 青霉素的抗菌效果与其分子中的内酰胺环有关。28、抗菌作用和临床应用，青霉素主要抑制g菌，而对某些g菌、螺旋体及放线菌也具有较强的抗菌作用，青霉素的抗菌作用与抑制细胞贴壁合成有关. 青霉素临床上用于治疗葡萄球菌感染，如脑膜炎、化脓炎、骨髓炎等，用于溶血性链球菌感染，如腹膜炎、产褥热、肺炎、淋病、梅毒、炭疽病毒等。29、菌种：黄青霉的生长发育可分为7个阶段：期：菌丝生长期，适于制种期：青霉素分泌细胞期：假菌丝自溶期。5.1青霉素生产菌特性、点青霉、30青霉素生产菌生长过程

12、、分生孢子萌发期菌丝繁殖期脂肪粒形成期脂肪粒减少、小空孢子大空胞自溶解、菌丝生长期、青霉素分泌细胞期、菌丝自溶解期第2期：菌丝繁殖、嗜盐化学基性、类脂肪小粒子。 第三期：脂肪包涵体、储藏物、嗜盐化学基性强。 第4期：空泡、嗜盐化学基性减弱，开始产生抗生素。 第5期：大空泡、中性染色大颗粒、脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。 第6期：个别细胞球自行溶解，细胞球内无颗粒，释放阿摩尼亚，pH升高。 第7期：菌丝完全自溶，只有空细胞贴壁。 发酵培养下生长过程和细胞学变化，镜检控制规定时间采样，显微镜观察7个时期的物态变化，发酵控制。 14期为菌丝生长期，3期菌体适于种子。 45期是生产期，生产能力最强，

13、通过工程措施，延长这个期，获得高产。 在第六期到来之前完成发酵。 准备了补充剂、工艺、6.1青霉素生产工艺、铸造模型、种子罐1和2、米孢子、预处理罐、过滤烟嘴、发酵罐、萃取器、蒸发器、工业盐、提取、工艺、工艺、冷冻干燥琼脂斜面摇镜头种培养基再次传递斜面，培养7天，形成绿色斜面孢子。 米孢子：应移植到小米或米固体培养基中，生长7天，注意25 :每批孢子进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。 6.2青霉素发酵工艺，(2)，种子罐培养工艺一级种子发酵：发芽罐，孢子发芽，形成菌丝。 培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙元素、玉米油、防沫剂等。 空气产水量1:3 (体积比)； 以300-350rpm为一盏茶搅

14、拌pH值自然、温度271、40h二级种子箱：繁殖箱、大量繁殖。 接种量10培养基：葡萄糖、玉米淀粉、玉米油、防沫剂等。 气流量1:1-1.5； 搅拌250-280rpm； pH自然，251。 10-14h质量：菌丝致密，菌丝粗，期，倍增期6-8h，(3)，生产罐培养技术三级罐：生产罐。 接种量20培养基：花生米粉、葡萄糖、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠金属钍、乙酰胺、CaCO3、玉米油、硅油150-200r/min； 前60小时3360 ph6.4-6. 6，26。 60小时后：ph6.7、24。 6.3发酵培养和工艺控制特罗尔操作方式：反复分批发酵槽： 100m3，投入80m3.6-10次，投入量

15、10，间隔24h。 发酵周期： 180-220h，发酵过程需要连续流过葡萄糖、硫酸铵和前体物质的苯乙酸盐，而且补糖率是最重要的控制指标，可以在不同时期逐步控制。 工艺控制特罗尔批处理操作特罗尔基质浓度前40小时：培养基中主要营养物质40小时后：低速连续补给葡萄糖、氮气源和苯乙酸等，维持一定的最佳浓度。 半饥饿状态：延长合成期，提高产量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加，降低了成本。 糖与6APA结合形成糖基6APA，影响青霉素的产量。 a .流加碳源根据残糖、pH、排瓦斯气体中的CO2和O2含量进行控制。 残糖为0.3-0.6左右，pH开始上升后放入砂糖。 葡萄糖的波动范围很窄，浓度过低的

16、话抗生素合成速度会变慢或停止，过高的话呼吸活性会降低，引起自我溶解。 (1)培养基、b .流加氮源控制玉米淀粉：最优选含有多种氨基酸和作为其前驱物的苯乙酸和诱导体。 补充无机氮源：硫酸铵、试剂氨水、尿素氨基氮浓度： 0.01-0.05%。 c .盐络离子控制无机盐：硫、磷、镁、钾元素等。 铁元素对青霉素合成有毒，在30-40 ug/ml以下。 在罐壁上涂上环氧树酯保护层。d .青霉素侧链前驱物添加时期：合成阶段种类：苯乙酸及其诱导体、乙酰胺、苯胺、苯乙酰甘氨酸毒性：抑制细胞球生长和青霉素合成。 对策：低浓度流加浓度：苯乙酸0.1%、乙酰胺0.05-0.08%控制：保持供给速度比生物合成需求稍大。 (2) .分泌细胞温度控制适当菌丝生长温度30、青霉素25。 20青霉素破坏少，周期长。 温度因变温控制、阶段而异。 生长阶段：是较高的温度，适当降低温度以使生长时间缩短的生产期有助于青霉素合成。 前期控制特罗尔26左右，后期降温控制特罗尔24，(3). pH控制特罗尔合成在适当的pH6.46.6左右，不要添加超过7.0的直接酸和碱：自动控制流加葡萄糖：定速变速取决于pH变化的速度。 pH值下降：补充CaCO3、通阿摩尼亚、尿素或提高通气量pH值上升：糖、大姨妈酸性物质(硫酸铵、油脂)、(4)溶解氧控制30饱和度，收率急剧下降10，引起不可逆的损害