实验二 淀粉酶活性的测定

1、2020/7/17,生物化学实验,Please be quiet, 上课了！,2020/7/17,生物化学实验,淀粉酶活性的测定,实 验 二,学时：3,2020/7/17,生物化学实验,1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定 的原理和方法。 2、掌握，-两种淀粉酶的理化特性。,一、实验目的：,2020/7/17,生物化学实验,二、实验原理: 淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。 天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(2025)：(7580)。,支链淀粉或糖原分支点的结构,-淀粉酶断裂 产生游离麦芽糖,2020/7/17,

2、生物化学实验,酶（enzyme） 是具有高效性与专一性的生物催化剂（biological catalyst）。 绝大多数酶的化学本质是蛋白质。 特点： 1、酶具有高效性（high catalytic power） 2、酶具有专一性（specifity）,2020/7/17,生物化学实验,酶活性（emzyme activity） 指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下酶促反应速度来表示，酶促反应速度可用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。,2020/7/17,生物化学实验,淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。 -淀粉酶耐热不耐酸，70加热15

3、min仍保持其活性,pH3.6时钝化；而-淀粉酶耐酸不耐热，70加热15min则钝化。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。,2020/7/17,生物化学实验,本实验采用加热法钝化-淀粉酶，测定-淀粉酶的活性。具体方法是利用3,5-二硝基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成的麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。,2020/7/17,生物化学实验,在碱性，加热条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS) 反应，还原糖被氧化成糖酸， DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。,2020/7/17,生物化学实验,1、实验材料：萌发的小麦种子 2、仪器：(1

4、) 可见分光光度计 (2) 恒温水浴锅 (3) 离心机 (4) 刻度试管 3、试剂：(1) 0.4M NaOH； (2)1%淀粉； (3) 3,5-二硝基水杨酸； (4)麦芽糖标准溶液(1mg/ml) (5)0.1M pH = 5.6的柠檬酸缓冲液。,三、实验材料、仪器和试剂：,2020/7/17,生物化学实验,四、实验步骤 1. 麦芽糖标准曲线的制作 取5支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂： 表1 麦芽糖标准曲线制作,2020/7/17,生物化学实验,以1号管作为空白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。以麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，A540nm为纵坐标，绘制标准曲线（通

5、过Excel线性回归曲线和回归方程）。,2020/7/17,生物化学实验,2、酶液的制备 ： 称取1.0 g(记录实际质量)萌发的小麦种子 于研钵中，加2ml水及少许石英砂，研成匀浆转入离心管用6ml蒸馏水分三次洗涤研钵均转入离心管用玻璃棒搅动20min等重 4000r/min离心10min上清夜转入50ml容量瓶定容，此提取液为淀粉酶原液，用于-淀粉酶活性和淀粉酶总活力测定。,2020/7/17,生物化学实验,3、-淀粉酶活性的测定： （1）取两支试管一支对照，一支测定各加淀粉酶原液1ml70准确加热15min冷却向对照管加4ml0.4MNaOH，终止酶活性； （2）向各管中均加入柠檬酸缓冲

6、液1ml ； （3）测定管和对照管于40水浴15min均加入2ml 40预热的淀粉立即40水浴保温5min取出后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH；,2020/7/17,生物化学实验,（4）取对照管和测定管中溶液各2ml,分别加入到刻度试管中各加2ml 3,5-二硝基水杨酸沸水浴5min冷却稀释至20ml刻度混匀以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调“零”，测定540nm处吸光度记录结果。,2020/7/17,生物化学实验,4、淀粉酶总活力的测定 （1）取两支试管一支对照，一支测定各加 酶液1ml，向对照管加4ml 0.4MNaOH，以钝化 酶的活性； （2）向各管中均加入柠檬酸

7、缓冲液1ml ； （3）测定管和对照管于40水浴15min均加入2ml 40预热的淀粉立即40水浴保温5min取出 后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH；,2020/7/17,生物化学实验,（3）取对照管和测定管中溶液各2ml，分别加入到刻度试管中各加2ml 3,5-二硝基水杨酸沸水浴5min冷却稀释至20ml刻度混匀以制作麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调“零”， 测定540nm处吸光度记录结果。,2020/7/17,生物化学实验,通过标准曲线或线性回归方程获得相应的麦芽糖含量（mg/ml），按下列公式计算-淀粉酶和-淀粉酶的活力。 -淀粉酶活力（麦芽糖毫克数/样品鲜重5分钟） =（ A2-A1）VDW 其中：A2：为测定试管中-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）； A1：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）。 V：为酶促反应体积； D：为酶液总体积。 W: 样品鲜重,五、实验结果与计算：,2020/7/17,生物化学实验,（）淀粉酶总活性（麦芽糖毫克数/样品鲜重5分钟） =（B2-B1）VD样品鲜重 B2：为（+）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）； B1：为对照管中麦芽糖的浓度（mg