细菌鉴定的一般步骤

1、细菌鉴定的一般步骤,李荣 南京农业大学资环院 办公室：综合楼B419 邮箱：,一、确保菌株的纯度,在鉴定菌株之前首先确保菌株的纯度。 假若菌株没有纯化好，将会做大量的无用功,二、PCR扩增16S rRNA片段,菌落直接PCR 菌体新鲜、加菌量少、阴性菌较阳性菌容易、退火温度要高点 DNA扩 PCR 高盐法或CTAB法提取细菌总DNA DNA量不要加太多,三、16S rRNA片段测序,PCR产物直接测序 条带特异，注意产物的浓度要足够，不要纯化 PCR产物克隆测序 挑单菌落，菌液测序或质粒测序。,四、系统发育树的构建,首先将所获得的16S rRNA片段序列在NCBI数据库中进行序列的比对（序列提

2、交GenBank 获得登录号） 从相关数据库下载相关模式种16S rRNA片段序列 采用MEGA 软件邻近法做树,核酸序列数据库,现在比较通用的核酸序列数据库有：,Genbank（national institutes of health ）、 RDP。 EMBL（European molecular biology laboratory）、 DDBJ（DNA data bank of Japan）,五、发育树的构建及作用,确认目标菌株跟模式菌株间的遗传距离 确认目标菌株的分类定位 同源性较低，认定可能为新种或新属，有必要重新扩增序列克隆测序,六、序列同源性差异分析,16S rRNA序列同源性

3、在大于97% 慎重考虑 16S rRNA序列同源性在97%以下 有做新种的意义 16S rRNA序列同源性在95%以下 有可能是新属,新属的判定依据,16S rRNA序列同源性在95%以下 拥有该科的共有特性 与相邻属的脂肪酸组成及含量有显著差异 生理生化差异明显 极性脂成分有差异 注意：判定依据要根据实际情况而定,七、几个发育树例子的分析,地衣芽孢杆菌模式种的生理生化特性,分类在一个支上，同源性大于99%，初步判定为地衣芽孢杆菌 生理生化特性的分析等 DNA杂交(实际情况而定),确定菌株种属,首先确定菌株属的定位（与同属模式菌株数据的比较） 查阅文献 到IJSEM杂志阅读邻近种属的分类文章,

4、形态学分析,菌落形态,菌株 wd的LB平板菌落照片,菌体照片间的比较,菌株 wd扫描电镜照片,Starkeya koreensis,Lm et al. IJSEM (2006), 56, 24092414,Ancylobacter rudongensis,IJSEM (2004), 54, 385388,Angulomicrobium amanitiforme,IJSEM (2004), 54, 651657,生理生化性质,IJSEM (2004), 54, 651657,选择模式种进行实验,菌种 15561 Angulomicrobium amanitifo 培养基编号： 1 830 菌种 5895 Angulomicrobium tetraedrale 培养基编号： 628 菌种 18406 Starkeya novella 培养基编号： 830 菌株送国际菌种保藏中心保藏,细胞壁脂肪酸（与模式种同步试验）,测定G+C含量,DNA-DNA杂交同源性测定,API实验进行生理生化的特性的获得 “Biolog”