发酵工业的无菌技术.ppt

1、第四章 发酵工业的无菌技术,4.1 发酵工业的无菌技术 一、几个概念 1、灭菌：用物理或化学方法杀死或除去物料 或 设备中所有微生物，包括营养细胞、细 菌芽孢和孢子。 2、消毒：用物理或化学方法杀死空气、容器内外 及环境中的微生物，一般只能杀死营养 细胞。,3、除菌：用过滤的方法除去空气或液体中的 微生物及其孢子。 二、常用的无菌技术和方法 1、干热灭菌法 2、湿热灭菌法 3、射线灭菌法 4、化学药剂灭菌法 5、过滤除菌法,4.2发酵培养基及设备管道灭菌 4.2.1湿热灭菌原理 一、微生物的热阻 1、致死温度：杀死微生物的极限温度 2、致死时间：在致死温度时，杀死全部微 生物所需的时间 3、热

2、阻：指微生物在某一特定条件（温度 和加热方式）下的致死时间,表4-3 几种微生物对湿热的相对抵抗力 微生物名称 大肠杆菌 细菌芽孢 霉菌孢子 病 毒 相对抵抗力 1 3 000 000 210 15 二、微生物的热死规律对数残留定律 实验证明，微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学反应的一级反应动力学，即：,N：任一时刻的活菌数（个） t：灭菌时间（min）,K：比热死速率常数（min-1） 取边界条件t0=0，N=N0，对（1）积分得,4.2.2 培养基灭菌温度和时间的选择 高温短时灭菌 4.2.3 培养基的灭菌方法 （1）分批灭菌 也称实消、实罐灭菌、间歇灭菌，是指将配制好的培养基输入发

3、酵罐内，直接通入蒸汽将培养基和所用设备一起进行灭菌的操作过程 。,在发酵罐中进行实罐灭菌，是典型的分批灭菌。全过程包括升温、保温、降温三个过程。,（2）连续灭菌 也称连消，指培养基在向发酵罐输送的同时，在罐外经过一套灭菌设备连续的加热灭菌，冷却后送入空消后的发酵罐的灭菌法。 连续灭菌的流程有3种：,（a）喷射加热连续灭菌流程,（b）喷淋冷却连续灭菌流程,（c）薄板换热器连续灭菌流程,（3）固体培养基灭菌 固体培养基也和液体培养基一样，要先蒸煮灭菌，但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差不易翻动，吸水加热容易成团，冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。该设备能承受一定压力

4、，装料后旋紧进出口盖，就如同密封容器。转鼓以0.51r/min徐徐转动，培养基得到翻动，蒸汽沿轴心通入加热培养基，达到一定温度后进行保温灭菌。灭菌完毕用真空泵沿空心轴抽真空，转鼓内压力降低，培养基冷却。,连续灭菌与分批灭菌的比较,（1）连续灭菌的优缺点,优点 保留较多的营养质量 容易放大 较易自动控制； 缩短灭菌周期； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少；,缺点 设备比较复杂，投资较大，染菌几率大，对蒸汽要求高，不适用大量固体物质的灭菌。,（2）分批灭菌的优缺点,优点 设备投资较少 染菌的危险性较小 人工操作较方便 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜,缺点

5、灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,4.2.4 设备和管道的灭菌 1、种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的 空罐灭菌及管道灭菌 2、空气总过滤器和分过滤器灭菌 3、种子培养基实罐灭菌 4、发酵培养基实罐灭菌 5、发酵培养基连续灭菌 6、补料实罐灭菌,4.2.5 影响培养基灭菌的其他因素 影响培养基灭菌除了所污染杂菌的种类、数量、灭菌时间和温度外，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。 （1）培养基成分 油脂，糖类及一定浓度的蛋白质可增加微生物的耐热性，另一些物质，如高浓度的盐类，色素等可削弱其耐热性。,（2）pH值 培养基pH为6.0

6、8.0时，微生物耐热性好，pH6.0时氢离子容易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡，所以培养基的pH值越低，灭菌所需时间越短。 （3）培养基的物理状态 颗粒小灭菌容易，颗粒大灭菌难。当培养基中有直径大于1mm的颗粒物则明显影响灭菌效果，蒸汽很难渗透到颗粒内部，称为“灭菌不透”，应过滤除去。,（4）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使传热困难，热难穿透过去杀灭微生物。 （5）微生物细胞的含水量 含水越多，微生物越易死亡（蛋白质易 变性） （6）微生物细胞的菌龄 菌龄越老则越不易死亡（蛋白质不易 变性） （7）空气排除情况 空气排出越彻底，微生物越易死亡,4.2.6 灭菌时间的计算 （

7、1）分批灭菌时间的计算 【例4-1】有一发酵罐内装40m3培养基，在121进行实罐灭菌。原污染程度为每1mL有2105个耐热细菌芽孢，121时灭菌速率常数为1.8min1。求灭菌失败机率为0.001时所需的灭菌时间。,有一发酵罐，内装80 m3培养基，在121温度下进行实罐灭菌。设每毫升培养基中含有耐热菌的芽孢数为1.25107个，大肠杆菌为5107个，霉菌为2.5107 个121时灭菌速率常数为0.0287s1。试求灭菌失败几率为0.001时所需的灭菌时间。,（2）连续灭菌时间的计算 【例4-2】 若将例3-1中的培养基采用连续灭菌，灭菌温度为131，此温度下灭菌速率常数为15min1，求灭

8、菌所需的维持时间。,4.3 空气除菌,4.3.1 空气除菌的方法 1、加热灭菌 2、静电除菌 3、介质过滤除菌,4.3.2 空气过滤除菌的原理和介质 按照过滤除菌机理不同，过滤除菌分为： 1、绝对过滤：尘埃或M直径过滤介质孔径 2、相对过滤：尘埃或M直径过滤介质孔径 这种相对过滤又称为深层介质过滤。 一、空气过滤除菌的原理 1. 布朗扩散作用 2. 拦截作用 4. 重力沉降 3. 惯性碰撞 5. 静电吸引, 当气流速度较大时，惯性撞击起主要作用， 除菌效率随气流速度增加而上升 当气流速度较小时，布朗扩散起主要作用， 除菌效率随气流速度增加而降低 当气流速度中等时，拦截起主要作用 当气流速度过大

9、时，已被捕集的微粒又被湍动的气流夹带返回气流中，除菌效率下降,二、空气过滤除菌的介质 1. 纤维状或颗粒状介质 棉花 玻璃纤维 活性炭 这类过滤介质对0.3m以下的颗粒过滤效率仅为99%，难以满足工业发酵的无菌要求，需多次过滤。 缺点：体积大，占用空间大，操作困难，装填介质费时费力且松紧度不易掌握，空气压力降大，介质灭菌和吹干耗用大量的蒸汽和空气。,深层棉花、活性炭过滤器的结构,2. 过滤纸类介质 超细玻璃纤维纸：这类介质过滤效果较好，对空气的阻力和压力降较小。缺点是强度不够，特别是受潮后强度更差。 石棉滤板：优点是湿强度大，受潮时不易穿孔或折断，能耐受蒸汽反复杀菌，使用时间长。缺点是由于纤维

10、直径大，过滤效率不高，只适用于空气分过滤器。 滤棒：,3. 烧结材料类介质 烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料等,4. 新型过滤介质 能除去全部M，但不能除去噬菌体的过滤介质，主要有膜孔小于0.22um的聚偏四氟乙烯（PVDF）和聚四氟乙烯（PTFE）膜材 能除去小至0.01um的微粒，可除去噬菌体，主要有Bio-X滤材和膨化聚四氟乙烯,4.3.3 空气过滤除菌的流程 一、空气的预处理： 空气的粗滤 空气的压缩和稳压 压缩空气的冷却 压缩空气除油除水 压缩空气的再加热,二、空气净化的一般流程： 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 分离器 加热器 总过滤器 分过滤器 无菌空气 1.冷热空气直接

11、混合的除菌流程,2.高效前置过滤器除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 高效前置过滤器 空压机 贮罐 冷却器 分离器 加热器 总过滤器,3. 两级冷却、分离、加热的除菌流程 空气吸气口 粗过滤器 空压机 贮罐 冷却器 旋风分离器 冷却器 丝网分离器 加热器 总过滤器,三、提高过滤效率的措施 减少进口空气的含菌数量 正确选择进风口 提高进口空气的采风位置，即高空采风 对压缩前的空气采用粗过滤处理 设计和安装合理的空气过滤器，选用除菌效率高的过滤介质 针对不同地区设计合理的空气处理流程 降低进入过滤器的空气相对湿度，保证过滤介质在干燥状态下工作,4.4 发酵工业污染的防治策略,4.4.1 污染的危害 一、表现 造成生产能力下降 造成产物收率低或产品质量下降 使发酵发生异常变化 使生产失败 导致整个发酵失败,二、具体分析 染菌对不同菌种发酵的影响 细菌 霉菌 酵母 不同发酵时期染菌对发酵的影响 种子扩培时期染菌 发酵前期染菌 发酵中期染菌 发酵后期染菌 3.染菌对发酵产物提取和产品质量的影响,4.4.2 杂菌污