层析法-f.ppt

1、色度学，又称为色谱Y(色谱)、背景和色谱，是俄罗斯植物学家迈克尔斯维特于1906年发现并命名的。他把植物叶片的色素填充到有吸附剂的柱上，各种色素徐璐以不同的速度流动，形成不同的色带，分离出来，称为“色谱法”。后来无色物质也可以用吸附柱色谱法分离。英国生物学家马丁和辛格。他们首先提出了色谱托盘理论和远见卓识的预言。1944年纸层分析后，随着层分析法的发展，薄层、亲和层分析、凝胶层分析、气相层分析、高压液相层分析(HPLC)等相继出现。分层分析法的基本原理、分层分析法是利用混合物中各组物理化学性质的差异(如吸附力、分子形状和大小、分子亲和力、分配系数等)，将各组分为两相(一相固定相、固定相)。另一

2、个上游通过固定相(称为流动相)，分布度不同，每个组可以徐璐以不同的速度移动，以达到分离目的。色谱的基本概念，固定相：固定相是色谱的矩阵。它可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离子交换剂等)或液体物质(如固定在硅或纤维素上的溶液)，这种基质可以与要分离的化合物起反向吸附、溶解、交换等作用。流动相：在分层分析过程中，要从固定相分离的物质向一个方向移动的液体、气体等称为流动相。在柱层分析中一般称为税制，在薄层分析中称为展示剂。根据工作形式的不同分类：柱层分析：固定在柱上，可以将样品沿一个方向移动，以便分离。纸层分析：用滤纸制作液体的载体，指向样品，然后展开成流动状，达到分离鉴定目的。薄层层分析：将适当粒

3、度的吸附剂铺成薄层，用类似于纸层分析的方法分离和鉴定物质。纸分层分析和薄层主要应用于小分子物质的快速检测分析和少量分离制备，通常一次性使用，柱分层应用于常用的层分析形式，样品分析、分离。生物化学中常用的凝胶层分析、离子交换层分析、亲和层分析、高效液相色谱等一般使用柱层分析格式。层次分析法的分类，层次分析法过程的机械分类：吸附层分析，任何两步都可以形成表面。其中一个阶段的物质或溶解的溶质聚集在这个表面的现象称为吸附。利用吸附剂徐璐对徐璐其他物质具有不同的吸附力，将混合物分离的现象称为吸附层。能够在磁表面收集到包括硅橡胶、氧化铝和活性炭在内的其他物质称为吸附剂。聚集在吸附剂表面的物质称为吸附剂。吸

4、附剂和吸附剂之间的作用除了物理作用外还有化学作用。例如，DNS-氨基酸双向聚酰亚胺薄膜层中分离的物质能吸附在聚酰亚胺薄膜上，是因为两者之间形成氢键。分层分析技术，1，原理：利用混合物，利用两种不熔液体(固定相和流动相)，纸色谱是最广泛的分布色谱。第二，分配系数：当溶质分布在两个徐璐不溶解的溶剂中时，固定相和流动相两相内的浓度比是常数，称为分配系数(KD)。分配系数小的溶质在流动上分配的杨怡多，移动快。分配系数大的溶质在固定相分配的杨怡较多，移动缓慢。所以可以徐璐分手。第三，载体上的物质移动速度为Rf: Rf，色斑中心到原点中心的距离，溶剂前部到原点中心的距离，特定溶剂中的物质分布系数恒定，Rf

5、值也恒定，因此可以根据Rf值识别分离的物质。离子交换层分析，离子交换层根据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力分离纯化。离子交换层的固定相是离子交换剂，不溶于水的惰性聚合物基质通过一定的化学反应共价键形成的离子交换剂可分为聚合物聚合物基质、电荷基团和平衡离子三部分。电荷基团与聚合物共价形成带电离子可交换基团。平衡离子是与电荷基团结合的相反离子，会引起溶液中其他离子基团的反向交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂与带正电的离子基团起交换作用，这被称为阳离子交换剂。平衡离子带负电荷的离子交换剂与带负电荷的离子基团起交换作用，这被称为负离子交换剂。离子交换剂包括树脂交换和纤维素交换。凝胶层分析技术

6、，1，基本原理概念(分子筛层分析):生物大分子通过含有固定相凝胶颗粒的层状柱时，根据分子大小分离的技术。原理：凝胶颗粒内部有多孔网状结构，分离的混合物流通过层分析柱时，大于凝胶孔直径的分子不能进入凝胶孔，凝胶颗粒之间的缝隙向下移动，先剥落。比网孔小的分子可以在一定程度上自由进出凝胶孔，经过柱子内部的行程延长，移动速度减慢，最终被冲洗掉。使用分配系数Kd测量，精确测量混合物中每个成分在柱内的溶出行为。Kd=(Ve-Vo)/Vi，Ve的一个成分从层柱中完全剥落时，溶液的体积Vo层柱内凝胶颗粒之间空隙的总体积Vi层柱内凝胶颗粒内部的总体积、外体积、耐水体积、底物体积、支柱床体积、洗脱体积、洗脱体积(

7、下一页矩阵体积表示凝胶粒子的实际骨骼体积。支柱床的体积是指凝胶柱所能容纳的总体积。洗脱体积是指冲洗样品中一组所需溶液的体积。我们将柱床体积设定为Vt，外水体积设定为Vo，内水体积设定为Vi，气质体积设定为Vg。VtVoViVg可以忽略，因为Vg相对较小。在分子的Kd1中，VeVo Vi没有完全阻止分子，在流动相和固定相上均匀分布，两相比为1 (C)。在0 Kd 1中，Ve=Vo Kd*Vi表示分子接收部分排斥(b)。亲和层析法、亲和层析是利用生物分子间的完全亲和力进行分离的分层分析技术。众所周知：抗原和抗体；酶和基质或辅酶或抑制剂；激素和受体RNA及其补充的DNA等等。它们之间都有一致的可逆转

8、的结合，这种结合力称为亲和力。亲和层析的分离原理是，将两个有亲和力的分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性将另一个分子分离纯化。9对DNS-AA的双向聚酰胺薄膜层进行了实验，研究了吸附分配层的原理1，聚酰胺薄膜层是特殊的分配层。混合物在流动上通过聚酰亚胺薄膜时，分离的物质和薄膜形成氢键，因此各物质形成氢键的能力不同，决定了吸附力的差异，吸附力展开层慢，吸附力弱，展开层速度快。2.电离层溶剂和分离物质在聚酰亚胺离子表面竞争形成氢键，选择适当的电离层溶剂，在溶剂和聚酰亚胺薄膜表面之间分配分离物质的系数上存在最大的差异。易溶于展示剂的动力作用大，展示层速度快，相反速度慢。在

9、本实验中，聚酰胺的胺基和氨基酸(AA)的羰基形成氢键，酰胺基端的羰基与AA的甲基或苯酚形成氢键。部分AA结构相似，如果仅使用一个溶剂系统分析单向层，就很难达到完全分离的目的。(莎士比亚、溶剂、溶剂、溶剂、溶剂、溶剂、溶剂、溶剂)因此，可以选择不同的溶剂系统进行双向色谱分析。本冰醋酸溶剂第二方向甲酸水，发色二甲基氨基甲酸氯(DNS-Cl)可以与氨基酸的游离氨基相结合，结合成DNS-氨基酸。形成的DNS-氨基酸在紫外线下呈黄绿色荧光。DNS-Cl AA DNS-AA HCl，反应副产品：DNS-NH2黄色荧光和DNS-OH蓝色荧光，DNS-氨基酸的双向色谱，谷，操作和注意事项，1，DNS氨基酸的制

10、造(完成)右下(2)苯冰醋酸层分析：展品前边缘可以在薄膜顶部2毫米处停止，冷风吹。(必须充分晾干吗？)，紫外线观察。(3)甲酸水层分析：将90度垂直于1相，在热风干燥器、紫外线灯下观察，用铅笔轻轻标出。(4)色谱后分析实验结果(见P30的单色谱)。(5)断层扫描后显示的薄膜作为点样点贴在左下角实验报告上。注意：(1)严格控制点样例位置和点样例直径。(2)展开层时，不要将点样品浸泡在溶剂系统中。(3)展览后必须通过吹风机吹干幕布。4)使用紫外线时，要注意使用时间较短。(。通过实验10凝胶层分析，分离出血红蛋白(Hb)和鱼精蛋白，原理Hb(红色，分子量64500)和异烟肼-鱼精蛋白(黄色，分子量2000-12000)。由于分子量不同，分配系数不同，通过交联葡聚糖凝胶G-50(sephadex)层分析柱用蒸馏水分离。不同颜色的话，可以直接观察到血红蛋白洗涤速度快，鱼精蛋白洗涤速度慢。操作及注意事项：1，安装支柱前，准备：用自来水洗净，用蒸馏水洗净，然后在分层柱上放入2-3ml蒸馏水，确保凝胶底部没有泡沫。2、支柱安装：将凝胶放入10-15厘米即可。防止泡沫和层，用玻璃棒平整表面。3，平衡：反复加入蒸馏水，10分4，加：蒸馏水流向支柱平面时，(不要杀死支柱平面)，立即接近支柱平面，小心滴下4滴样品(注意不要搅动床面)。5 .收