小鼠染色体.ppt

1、实验十一 小鼠骨髓细胞染色体标本制备与观察,一、实验原理,骨髓细胞具有高度的分裂增殖能力。因此可以直接得到中期细胞而不必象血淋巴细胞或组织那样要经过体外培养。经秋水仙素处理后，分裂增殖中的骨髓细胞由于纺缍体的形成受到抑制，染色体不能正常趋向两极而使之停留于中期，同时染色体缩短，轮廓清晰，把收获的细胞进行低渗，固定处理，使细胞处于膨胀状态，再将细胞悬液滴在载片上，使细胞破裂，染色体散开，染色后即可观察到染色体。,二、实验目的,学习并掌握小鼠骨髓细胞染色体的制备方法。 观察小鼠染色体的形态特征,统计细胞的染色体数目。,小白鼠（2n=40）,三、实验材料,四、实验器具和药品,1.器具：注射器（1ml

2、，5ml各一支）、托盘、解剖剪、镊子、吸管、离心管、离心机、载片、滤纸、白纱布小块等。 2.药品： 0.15mg/ml 秋水仙素， 1%柠檬酸三钠，固定液（3份甲醇，1份冰乙酸，临用时现配），Giemsa染液，2.2%柠檬酸钠，0.01M磷酸缓冲液（PBS）pH6.8。,购买小鼠（体重30克最佳；尽量雌雄各半） 溶液配制： 2.2%柠檬酸三钠：称11g柠檬酸三钠到500ml蒸馏水中，充分溶解； 1%柠檬酸三钠：取5g柠檬酸三钠溶解到500ml蒸馏水中，充分溶解； PBS（pH6.8): A液：取Na2HPO4 12g溶于500ml蒸水中，充分溶解； B液：取KH2PO4 4.55g溶于500m

3、l蒸水中，充分溶解； 使用时A、B液等体积混合，即为pH6.8的PBS； 0.15mg/ml 秋水仙素：取秋水仙素15mg溶于100ml 0.85%生理盐水 中，混匀； 75%酒精：取375ml 95%乙醇，加入125ml馏蒸水；,五、实验准备,六、实验步骤,1、处理：用1.5mg/kg秋水仙素腹腔注射处理小鼠（注射量为0.1ml/10g体重）。即用以上配制的秋水仙溶液按每10g体重注射0.1ml。注射后3-24小时，可以取骨髓。,2. 处死：断颈法处死小鼠。剪刀剪开腿部的皮肤，用镊子夹住小鼠的股骨，剪去股骨周围的肌肉，将小鼠的两股骨取出，擦净股骨上的肌肉。去股骨的髋面，将吸有2.2%柠檬酸三

4、钠溶液的小注射器 的针头插入，反复几 次吹出骨髓细胞，反 复吹打直至股骨呈白 色，制成细胞悬液。,3. 低渗：将细胞悬液在1000rpm/min离心5min，弃除上 清液，留0.5ml摇匀。向细胞液中再加入1%的柠檬酸三 钠溶液 5ml 用吸管轻吹打均匀，在室温低渗 30min。低 渗期间，配制固定液，即甲醇：冰醋酸为3:1（v/v)，置 4 冰箱中备用。 4. 预固定：在低渗后的细胞悬液中直接加入0.5ml ( 10滴左右)固定液进行预固定5min ；然后将细胞悬液1000rpm/ min 离心5分钟，留1ml原液，摇匀。加入新配制的固定液至6ml， 吹打均匀，固定5分钟(第1次) ，再在1

5、000rpm/min离心3-5min，去掉上清液。,六、实验步骤,六、实验步骤,5. 固定（第2次）：沿离心管壁慢慢加入新配制的固定 液6ml，用吸管轻轻吹打均匀，室温下固定5min， 1000rpm/min 3min，弃去上清；如此反复固定两次 （共固定3次）。 6. 根据管底细胞量的多少，加入新配制 的固定液0.3 0.8ml，用吸管打均匀， 使其形成细胞悬液。,六、实验步骤,7. 滴片：将预冷的载玻片（0冰浴），水平或倾斜45 角放置，用吸管吸取细胞悬液，从约0.5 -1m高处滴 12滴到片子上，用口将其吹干，静置使其干燥。 8. 染色：将干燥的玻片放入2ml吉姆萨原液加入40ml磷酸缓冲液（pH6.8）配成的染液中染色20min，用磷酸缓冲液（pH6.8）冲洗，晾干后镜检。,七、观察,低倍镜寻找中期分裂相，然后用高倍镜和油镜观察染色体形态，统计染色体数目。 可见小鼠的40条染色体呈紫红色。,小鼠骨髓细胞的40条染色体,小鼠骨髓细胞染色体图,小鼠骨髓细胞染色体放大图(10100),作业,1.找到一个分裂相良好的区域，统计小鼠2n染色体的数目，仔细