实验四 细菌质粒的接合转移.ppt

1、实验4细菌质粒的接合和转移，李小华程国军，1。客观要求，了解自然条件下微生物遗传信息的传递方式；掌握细菌质粒转移的原理和过程。2.基本原理：在质粒转移过程中，供体细菌和受体细菌细胞通过结合作用紧密接触，质粒从供体细胞转移到受体细胞，同时进行质粒复制，这就是结合转移的过程。根据它们是否能自主转移，天然存在的质粒可分为两类。1转移质粒：大部分是低拷贝的大质粒，包含完整的转移操作基因(tra)和转移起始位点。它可以在同种或近亲的细菌细胞之间转移。例如，大肠杆菌：f因子，R1，R100，R6K，RP4天蓝色链霉菌：育性因子pSCP1，pSCP2 2不可转移质粒：大多是具有高拷贝的小质粒，如大肠杆菌的C

2、olE1和RSF1010。由于缺乏tra，它不能自主转移，但由于它含有类似于F质粒的bom(或nic)位点或mob(动员)，它可以被携带tra的转移质粒诱导转移。转铁蛋白的筛选，筛选培养基是：抗生素基础培养基；供体和辅助大肠杆菌都是营养缺陷型的，不能在基本培养基上生长；未转化的受体细菌不能在有抗生素的平板上生长。3:实验菌株，供体菌株：大肠杆菌DH5(pTR102) (TcR)，含有mob基因；受体菌株为中国紫云英根瘤菌；辅助菌株：大肠杆菌MM294 (pPK2073)(SpeR)含有tra基因。(4)实验内容：准备将受体、供体和辅助菌分别培养至对数生长期：供体菌：大肠杆菌DH5(pTR102

3、) (TcR)、LB Tc 20g /ml，37振荡培养一夜；将受体菌株：中国根瘤菌TY 28振荡培养2天。将辅助细菌：大肠杆菌MM294 (pPK2073)(SpeR)、LB Spe 50 g/ml 37振荡一夜，用可调定量移液管吸收0.4ml供体细菌、辅助细菌和0.6ml受体细菌，将所有细菌放入同一个eppdorf试管(每个学生一个)中，并以10000 rpm的速度放入离心机中。倒入上清液，向沉淀物中加入1毫升TY液体，用吸头上下抽吸，清洗细菌，以10000转/分钟离心1分钟，倒入上清液，留下约100升用于悬浮细菌。翻转TY板，然后用镊子取出已消毒的滤纸片，并将其粘贴在准备好的TY板上(每

4、2名学生1片，每板2-3片)。用200升的吸头吸取eppdorf管中沉淀的细菌，将其分解成浓缩的细菌溶液，将其添加到滤纸片的中心(不要倾斜平板以防止细菌溶液流出滤纸片)，并吹干。两天28块。操作步骤(第一天)，倒入SM板，溶解基础培养基(SM)，加入1/1000维生素混合物，然后加入相应量的四环素(15U/ml)，每2人一碟。制备另一瓶不含抗生素的基本培养基作为对照。将倒入的平板用报纸包好，放入冰箱4中备用。(注意：四环素在强光下容易分解)。向灭菌后的青霉素瓶中加入3毫升无菌水，用无菌镊子将培养好的TY平板上的滤纸放入水中，用振动搅拌器清洗细菌，并充分破碎。将0.9毫升无菌水加入1毫升ep管，取0.1毫升细菌溶液，混合均匀。吸起200升的盘子。几个学生拿了另一种稀释剂，用了一盘不含Tc的SM作为对照。在平板上培养4-6天后，观察28天的结果。操作步骤(第三天)，5:实验报告内容，转移频率=SMTc板