分子生物学课件第10讲.ppt

1、第四章 以修复作用为中心的DNA的安全保障体系,导致DNA不稳定的因素 1，偶然的复制错误 2，环境紫外线、电离辐射化学物质（突变剂）造成的核酸分子损伤 3，外源遗传物质的侵入,保证DNA稳定性的机制 1，复制修复系统 2，损伤修复系统 3，限制-修复系统,第一节 复制修复,一、尿嘧啶糖基酶系统 （一）DNA中尿嘧啶的产生 （二）尿嘧啶糖基酶系统的组成 （三）修复过程,二、错配修复系统（mismatch repair system） （一）错配修复系统的组成 （二）错配修复的过程,1，错配矫正酶与未甲基化的GATC及同一条链上的错配碱基结合 2，错配矫正酶在两者之间切除一段包括错配碱基的DNA

2、单链,3，DNA聚合酶III进行缺口充填 4，DNA连接酶连接切刻,（三）错配修复系统其他作用 1，去除渗入DNA的碱基类似物 2，在基因转换中起重要作用,第二节 损伤修复,致损伤因素 DNA分子损伤的类型 一、胸腺嘧啶二聚体的产生及其后果 二、胸腺嘧啶二聚体修复的生物学指征 （一）细菌的活存曲线 （二）修复类型,1，光复活（photoreactivation） 2，暗修复 除了可作用于胸腺嘧啶二聚体外，还可以修复其他类型的损伤，包括： （1）切除修复 （2）重组修复 （3）SOS修复 （4）二聚体糖基酶修复,三、胸腺嘧啶二聚体修复的分子生物学机制 (一）光复活（photoreactivati

3、on） 1，光复活的定义 2，光复活的过 （二）切除修复 1，切除修复一般过程 2，大肠杆菌的切除修复 （1）修复过程,（2）大肠杆菌切除修复的类型 短补丁修复（short-patch repair） 长补丁修复（long-patch repair） 3，真核生物的切除修复,（三）重组修复 1，除Uvr系统之外，还存在其他的暗修复系统 2，重组修复（复制后修复）的机制 （1）重组修复的姐妹链交换假说（图4-10） （2）重组修复所涉及的基因,（四）SOS修复 1,SOS反应 2,SOS修复的概念 3,SOS修复的结果 4,RecA蛋白在SOS修复中的作用,(1)RecA蛋白的主要生化活性 (2

4、) RecA蛋白的作用 5,LexA蛋白在在SOS修复中的作用 (1)LexA蛋白的作用 是一种阻遏蛋白,结合于SOS系统中各基因的操作子上,使得这些基因不能产生转录产物,对自身基因的表达也有负向控制作用,但正常细胞中其表达量足以阻遏所有SOS基因的表达 当细胞DNA复制受阻时，LexA蛋白被RecA蛋白触发，发生自身催化的水解作用，SOS系统被激活，lexA基因表达也增加,DNA复制正常后,RecA蛋白失活,LexA蛋白恢复对SOS系统的阻遏作用,(2)由LexA控制的SOS基因构成一个调控元 LexA控制17个基因,统称din(damage inducible genes)基因,或SOS基

5、因 SOS框：所有SOS基因的操作子都含有20bp的LexA结合位点,称为SOS框(SOS box),（五）嘧啶二聚体糖基酶修复系统 与非标准碱基的修复机制相同,四、其他损伤类型及其修复 （一）非标准碱基的修复 1，非标准碱基及其相应的DNA糖基酶 非标准碱基包括：尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤等 第一类DNA糖基酶无内在AP内切酶活性 第二类DNA糖基酶有内在AP内切酶活性,2， DNA糖基酶的修复机制 与尿嘧啶糖基酶的修复机制相同 第一类去除非标准碱基后，还可以通过DNA碱基插入酶进行修复,（二）碱基的丢失 1，去嘌呤作用（depurination）：嘌呤碱基自发水解导致 2，无碱基内切

6、酶的作用 修复去嘌呤作用造成的损伤，也负责修复DNA中的尿嘧啶和次黄嘌呤 特异切断无碱基核糖的5-磷酸的3-酯键,3，碱基插入酶 目前只发现一种嘌呤碱基插入酶 专一性在AP位点插入互补的嘌呤碱基 嘌呤碱基的供体可以是自由碱基或嘌呤脱氧核苷。大肠杆菌的酶可以利用dATP和dGTP,（三）烷基化损伤的修复 1，烷基化的主要位点 嘌呤碱基的N-7、N-3位、O-6位以及磷酸骨架 2，Ada蛋白在烷基化损伤的修复中的作用,（1）ada基因产物 Ada蛋白（O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶，MGMT）有354个Aa，39KDa （2）Ada蛋白的自杀行为 Ada蛋白可去除鸟嘌呤O6甲基，及甲基磷酸三酯上的甲基

7、。两种甲基分别不可逆地结合于该酶的Cys321和Cys69上。去除一个甲基要消耗一个酶分子。,3，E.coli对烷基化的适应性反应 （1） Ada蛋白的作用 携带了甲基的Ada蛋白成为自身基因和其他三个基因（alkA，alkB，aidB）的诱导物，结合于基因RNA聚合酶结合位点的上游。其结合位点的一致序列为：AAANNAAAGCGCA,（2）alkA基因的作用 编码烷基化DNA糖基酶，该酶能去除3-甲基腺嘌呤， 3-甲基鸟嘌呤，O2-甲基胞嘧啶， O2-甲基胸腺嘧啶等烷基化碱基 （3）alkB的作用 基因产物负责细胞毒素损伤的DNA的切除修复,（四）链的断裂 1，造成DNA链断裂的因素 2，修

8、复方式 （1）单链断裂修复 有一部分是直接通过DNA连接酶将切刻两端的5磷酸根与相邻的3羟基连接加以修复,（2）双链断裂修复 已知参与双链断裂修复的哺乳动物基因有： DNA-PK，XR-1，XRFCCI基因 修复的简单过程是：断裂的末端被切平，产生3-OH和5-P，然后两个片段被连接起来。,（五）交联 1，致交联因素 某些抗生素（如丝裂霉素） 致癌剂和化疗药 2，交联种类 链内交联 链间交联 3，修复方式 主要依靠切除修复,（六）真核生物的修复系统 1，酵母 与辐射损伤修复有关的基因统称为rad基因，分成三组： （1）与切除修复有关 （2）与复制后修复有关 （3）与重组修复有关,各种修复都与转

9、录过程有关，都倾向性地修复具转录活性的基因，而且是首先修复模板链。可能修复与RNA聚合酶有联系。现已知rad3基因编码一种螺旋酶（helicase），是与RNA聚合酶结合的一种转录因子，是对损伤区切割所必需的。,2，哺乳动物 对损伤DNA的修复机制同原核细胞的切除修复机制相似。已知哺乳动物切除修复相关的基因与酵母的rad基因存在同源性，表明切除修复机制在各种生物中是高度保守的 哺乳动物中已发现了重组修复机制。这些修复系统都与遗传重组过程有关,3，真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化与DNA修复的关系 （1）真核生物蛋白质的多聚ADP核糖基化（ADP-ribosylation） 在DNA断裂作用的

10、刺激下，ADP核糖基转移酶（ADPRT）迅速从NAD+上将ADP核糖基转移到许多核蛋白（包括ADPRT自身）上。,（2）多聚ADP核糖基化的可能作用 观点一 核糖基化的蛋白质通过目前未知的途径促进DNA的修复,观点二 ADP核糖基化使磷酸核糖焦磷酸（PRPP）和ATP的储备急剧下降，DNA损伤严重的情况下可能导致细胞死亡。 意义：防止畸变的DAN修复结果被复制而固定下来,第三节 限制与修饰（restriction and modification）,一、限制-修饰现象 1，大肠杆菌噬菌体的限制和修饰模式 表4-2,2，大肠杆菌的限制-修饰系统 （1）限制-修饰作用：大肠杆菌的一种酶系统可以识别

11、外来的DNA，并以其限制性内切酶活性将之切断（限制）；另一方面，该系统可以识别细胞内DNA中相同的限制性内切酶切割位点，并对位点内的腺嘌呤或胞嘧啶进行甲基化修饰（修饰），使之免遭限制性切割，这两方面的作用即为限制-修饰作用。大肠杆菌的这种酶系统就称为限制-修饰系统。,3，居民DNA 同一细胞内具有同样的限制-修饰模式的不同类型的DNA，包括细胞DNA，质粒DNA，噬菌体DNA等,二、限制-修饰系统的分类 （一）细菌中三种不同类型的修饰-限制酶 表4-3 （二）II类修饰-限制酶,1，酶分子的构成 限制酶和修饰酶是独立的两个酶 2，识别位点 一般为4-6个bp的回文序列 3，切割位点 大多数酶作

12、用于底物DNA双链，位点在识别序列中或靠近识别序列 少数酶能作用于回文序列相应DNA单链序列,4，对底物的作用 全甲基化底物：不限制，不修饰 半甲基化底物：不限制，修饰 非甲基化底物：限制，不修饰,5，酶切位点 粘性末端和平齐末端：限制酶在DNA两条链上的切口位置不同产生不同的末端。粘性末端可以是5端的，也可以是3端的。 同位酶：识别相同序列而切点不同的限制酶 同尾酶：识别序列不同而切割产生的粘性末端相同的限制酶,（三）I类酶 1，酶分子的构成 （1）三个亚基： R、M、S亚基 分别由hsdR、hsdM、和hsdS基因编码； 三个基因属同一个操纵元,（2）两种功能 R、M亚基负责限制和修饰 S

13、亚基负责识别DNA序列上特异靶位点 （3）基因突变和万一保安机制 三个基因突变的表型 万一保安机制：M亚基参与R亚基的功能，使M亚基突变时不致造成致死表型,2，I类酶的作用位点 （1）EcoB和EcoK的识别位点：一段3bp的序列和一段4bp的序列中间夹着一段任意序列 EcoB的识别序列： TGA（N）8TGCT EcoK的识别序列： AAC（N）6GTGC,（2） EcoB和EcoK的甲基化位点 EcoB的甲基化位点：DNA双链上N8任意序列两侧的两个腺嘌呤 EcoK的甲基化位点：不详 （3） I类酶的切割位点 距识别位点1000bp以上,3， I类酶的限制-修饰机制 图4-15 （1）M亚

14、基首先与辅助因子S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合，酶分子变构处于活化状态 （2）酶-SAM与DNA结合后，在ATP的参与下，对不同甲基化程度的底物产生不同的限制-修饰作用 限制性切割位点的序列无特异性，但位点的选择也并非是完全随机的,4， I类酶识别切割位点的机制 （1）酶移动假说 酶分子与识别位点结合 酶分子沿着DNA移动（原因未知）直到它实施切割,（2）DNA移动假说 酶分子有两个位点与识别位点的两端特异性碱基序列结合 在ATP存在时，酶分子发生变构，以一个位点与DNA的一端特异性序列结合（可能是四个碱基的序列）,酶分子将另一边的DNA双螺旋从中间拉过来，通过分子上不结合DNA的结合位点的检查，发现DNA上的切割位点，将DNA的一条链切断 消耗大量ATP，释放共约70b的寡核苷酸片段 可能由第二个酶分子将DNA的另一条链切断,（四）III类酶 III类酶非常稀有，目前只有三个系统得到了研究，即大肠杆菌质粒P1、P15编码的EcoP1和EcoP15，以及流感菌Rf中的Hinf,1，酶的组成及功能 R亚基，负责限制反应；R亚基基因突变，产生R-M+表型 MS亚基，负责识别和修饰；MS基因突变，可产生R-M-（识别区突变)或R+M-致死突变（修饰部分突变）,2，识别和修饰位点 同一个位