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文档简介

1、,荧光定量PCR实验技术讲座,报告人：徐 歆 2013. 3. 20,简 介 工作原理 试 验 注意点,主要内容,简 介,什么是荧光定量PCR？,在PCR反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA 量的增加 灵敏度极高，用于准确定量初始模板数量 荧光定量PCR 结果可以用于定性（判断一段序列的有无），也可以用于定量（确定DNA 拷贝数），即qPCR,工作原理,工作原理（SYBR GREEN）,工作原理,x-轴表示PCR 循环数，y-轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系,工作原理,到达相同荧光强度（R）需要的循环数（C）越小，则初始模板量越多,试 验,试 验

2、引物的设计,NCBI Genbank查询目的基因mRNA序列 根据mRNA序列中的CDS设计引物 要求：17 24 mers，CG = 40 60%, Tm 60 引物质量尽可能避免自身及上下游错配、发卡结构 Primer-BLAST确认引物的特异性，避免扩增出1000 bp以下的非目的产物,试 验cDNA样品的制备,提取Total RNA（培养细胞或组织） 保证RNA质量（OD260/OD280 = 1.82.2） RNA尽快反转录为cDNA 按实验方案稀释cDNA,试 验加 样,根据待测样本及目的基因计算反应孔数目，选择96孔反应板或8联管进行试验 先配制不同样本的大体系PCR反应液（引物

3、除外），再分装至小管，加入不同引物 每个样本的同一基因建议做23个重复孔 将反应液各组分混合均匀，去除液面的气泡,试 验程序的设置,背参染料的荧光强度不随PCR反应变化，用于校正孔与孔之间的荧光干扰或反应体积变化对SYBR GREEN荧光强度的影响,试 验结果的查看,试 验数据导出,试 验数据分析（相对定量）,2-C (Livak)法 用参照基因（如-actin）的C值校正目的基因的C值，求出C值 用对照组样品的C值校正处理组样品的C值，求出C值 相对表达比率为2-C ，相对表达水平为2-C,试 验数据分析（相对定量）,统计软件（SPSS或SAS）对不同组的相对表达比率（2-C）进行多重比较（LSD、Duncan等方法）,注意点,实验方案要周密，分组设置完整，切勿遗漏，避免补做或重做 引物特异性要好

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