山东花生腐霉根腐病病原鉴定

1、山东花生腐霉根腐病病原鉴定摘要：利用组织分离技术和选择性培养基纯化技术对山东地区花生腐霉根腐病的病原菌进行了分离和纯化。按照柯赫法则，根据余永年真菌形态学鉴定方法及利用ITS序列比对等分子生物学方法对病原菌进行了鉴定。结果表明，引起山东地区花生腐霉根腐病的病原菌为群结腐霉（Pythium myriotylum Drechsler）、旋柄腐霉（Pythium helicoides Drechsler）、畸雌腐霉（Pythium irregulare Buisman）以及终极腐霉（Pythium ultimum Trow）。关键词：花生；腐霉；根腐病；鉴定Identification of Pea

2、nut Pythium Root Rot Pathogen in Shandong Abstract：Pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was isolated and purified by techniques of tissue isolation and selective media. Based on Kochs rule,the pathogen was identified.by the methods of Fungal morphological and ITS sequence alignme

3、nt. And it indicated that the pathogen of peanut Pythium root rot pathogen in Shandong was Pythium myriotylum Drechsler、Pythium helicoides Drechsler、Pythium irregulare Buisman and Pythium ultimum Trow.Key words: peanut; Pythium; root rot; identification近年来,随着种植花生经济效益的不断提高,山东省的花生种植面积也在不断增长，目前主要划分的两大优

4、势区域，一是以种植春花生为主的胶东半岛、鲁中和鲁东南地区的29个县；二是以种植夏花生为主的鲁西和鲁西南地区黄河故道的5个县。其中花生腐霉根腐病是影响山东花生产量的主要因素之一，由于种植面积大，产区集中，连作面积广，给花生生产造成了很大危害。花生根部病害调查分离时，我们从以上大部分地区的花生病株中分离到了腐霉菌（Pythium sp），为了明确山东省花生腐霉根腐病的病原特征及生物学特性，为防治提供依据，作者于2007-2009年度对山东花生腐霉根腐病病原进行了研究,结果报道如下。1 材料与方法1.1 症状表现调查方法对山东地区不同花生产区的花生进行田间病害调查并采集发病样本，记录花生从播种到收获

5、是否能受到腐霉的侵染而发病，被害植株是否萎蔫，须根的腐烂情况以及初生根、次生根和主根的尖端是否特别容易受害，根系是否完全被破坏1。1.2 病原菌分离与纯化方法将从田间采集的病株须根系用自来水冲洗干净,用吸水纸吸干表面的水珠,将病株须根系剪成长5mm 的小块,将其放置于VP3 选择性培养基中2 25培养。24h后不断观察，发现有腐霉长出立即转移到CMA培养基上放在25恒温箱中培养，纯化，转入CMA斜面培养，5d后菌丝长满，放入4冰箱保存备用。1.3 病原菌致病性测定方法按照柯赫法则3，采用盆栽接种测定方法测定病原菌的致病性，将土壤灭菌后装花盆，种花生(花育22)，花生团棵后，把4保存的菌种在CM

6、A培养基上25扩繁，长满菌丝后按4%（菌：土）的接种量，与花盆内的土壤混匀，保湿筒保湿48h后调查发病情况，调查持续一周，从病组织分离回接菌种，并作单菌丝培养。1.4 病原菌种类鉴定方法1.4.1 病原菌最适温度及pH值测定将PDA培养基制成平板。将事先培养好的直径5mm的病菌圆饼转接在平板中央，分别置于4、10、15、20、25、30和35进行病原菌最适生长温度测定。在将PDA培养基的pH值调至3-12，按照上述方法将接好菌饼的培养皿置于25恒温培养箱内培养，定期观察，记录菌落生长速率以及菌落形态特征。1.4.2 病原菌形态观察将腐霉菌在CMA平板培养基上培养，3d后移取边缘菌丝至皮氏（Pe

7、tri）培养液中，25培养13d挑取孢子囊，观察孢子囊形态，有无层出现象，游动孢子的游出方式，并且测量孢子囊大小。待出现藏卵器、雄器、卵孢子后，观察藏卵器、雄器的形态，着生位置，配合情况及卵孢子的形态特征，每项指标分别观察测量100个，并且测量其大小，计算平均值4。鉴定则依据孢子囊、藏卵器、雄器、卵孢子的形态特征，大小及其特性来鉴定，主要参考中国真菌志（第六卷，科学出版社，余永年主编）进行鉴定5。1.4.3 病原菌ITS序列测定将事先用CMA平板培养好的病原菌的菌落刮取下来，利用Biospin植物基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，而后利用通用引物(ITS1、 ITS4)进行PCR扩增，最后

8、利用Biospin胶回收试剂盒进行回收并测序6。鉴定则参照NCBI(美国国立生物技术信息中心)中的ITS序列，利用DNAstar等相关软件进行相似序列比对。2 结果与分析2.1 症状表现田间调查我们发现，鲁东南地区的莒县、莒南县花生根腐病害较为严重；而鲁中地区的宁阳县花生茎腐病和根腐病造成了花生的大面积减产；胶东半岛的招远则以根腐病、白绢病为主；鲁西和鲁西南地区的茌平、鄄城和济阳苗期主要以茎腐病为主，中后期则以根腐病为主。2.2 分离、纯化出病原菌从莒县、宁阳县、济阳县、茌平以及招远等地共采集花生病株145株，利用VP3 选择性培养基分离病组织672块，腐霉菌、镰刀菌、色二孢、杂菌出现的频率分

9、别为38.1%、34.7%、21.7%和5.5%，在上述地方采集病根和病土，用黄瓜诱捕的方法分离351块，腐霉菌、镰刀菌、色二孢、杂菌出现的频率分别为65.5%、8.8%、24.5%和1.2%。表1 VP3培养基分离病原菌比例Table 1 The proportion of separated pathogenic fungi of VP3地点Site块数Number腐霉菌Pythium镰刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它杂菌Other fungi莒县1765573408宁阳226126955济阳131252581茌平79243124招远6026925合计672256233146

10、37表1 黄瓜诱捕法分离病原菌比例Table 2 The proportion of separated pathogenic fungi of Cucumber Trapping地点Site块数Number腐霉菌Pythium镰刀菌Fusarium色二孢Diplodia其它杂菌Other fungi莒县103731020宁阳776611济阳10151941茌平17170招远53231254合计35123031864从上表1和表2可以看出腐霉菌的出现频率最高，利用水琼脂培养基对疑似腐霉菌进行了纯化培养，得到纯化培养物。经过病原菌形态观察以及ITS序列测定，初步确定这些病原菌为腐霉（Pythiu

11、m sp）。2.3 病原菌的致病性测定随机调查接菌四种不同腐霉的盆栽花生各8株，结果表明，在盆栽接菌群结腐霉、旋柄腐霉、畸雌腐霉以及终极腐霉3天后，大部分花生表现出典型的田间发病症状，对照植株则生长正常。发病率依次是畸雌腐霉群结腐霉旋柄腐霉终极腐霉（见表3）。通过对病变组织内病原菌的重新分离以及显微观察测量鉴定，新分离病菌与原接种病菌相同，表明这些腐霉菌株为花生的致病菌。表3 花生致病性测定Table 3 Determination of pathogenicity of peanut plants菌株采集地Strain collection sites接菌种类Species of inocu

12、lation发病率Morbidity病情指数Disease index宁阳P. ultimum81.8237.66济阳P. myriotylum88.8966.67招远P. helicoides83.3352.38莒县P. irregulare100.0042.862.4 病原菌的种类 鉴定结果表明：这些菌株为腐霉菌属的群结腐霉（Pythium myriotylum Drechsler）、旋柄腐霉（Pythium helicoides Drechsler）、畸雌腐霉（Pythium irregulare Buisman）以及终极腐霉（Pythium ultimum Trow）。试验结果表明：4

13、种腐霉病原菌最适生长温度介于25-30之间，低于5和高于36菌丝生长缓慢；4种腐霉病原菌最适pH值介于6-7之间。2.4.1 不同采集地腐霉形态学鉴定如图图4 群结腐霉的形态Fig. 4 Morphology of Pythium myriotylum1-2 孢子囊3 泡囊4-5 泡囊破裂产生游动孢子6 休止孢子7 休止孢子萌发产生芽管8-9 藏卵器、雄器和卵孢子标尺=10mPythium myriotylum Drechsler菌落形态：菌落在CMA上无特定形态，菌丝发达，分枝，粗3.99.0m 。孢子囊由膨大与不膨大菌丝构成，膨大部分指状或裂瓣状，顶生或间生；游动孢子肾形，双鞭毛。藏卵器球

14、形或近球形，直径2431.5（平均28.3）m，平滑。顶生或间生。雄器棒状或钩状，着生于分枝的雄器柄顶端，与藏卵器接触，每个藏卵器有多个雄器，卵孢子球形，直径2129（平均26.3）m，平滑，不满器，偶有满器，壁厚1.52.0（平均1.76）m，内含贮物球和折光体各一个。（图4）图5 旋柄腐霉的形态Fig. 5 Morphology of Pythium helicoides1-2 孢子囊3 孢囊层出4-6藏卵器、雄器和卵孢子标尺=10mPythium helicoides Drechsler菌落形态： 菌落在CMA上呈放射状，气生菌丝棉絮状。菌丝发达，粗3.55.2m，分枝繁茂。孢子囊梨形、

15、倒卵形，较少近球形，具有一乳突，顶生或间生，近球形孢子囊直径为18.236.7（平均28.6）m，梨形孢子囊为20.538.2m1932.5m；孢子囊有孢囊层出现象，常常在孢子囊内部层出23层。藏卵器球形，直径28.643.2（平均37.5）m，平滑，多数为顶生，少数切生。雄器较大，整个附着在藏卵器上，多橘瓣状，少数棍棒状，少数边缘不规则，卵孢子球形，直径2232（平均27.8）m，平滑，不满器。（图5）图6 畸雌腐霉的形态Fig.6 Morphology of Pythium irregulare1-2 孢子囊3-7 藏卵器和雄器8-9 卵孢子标尺=10mPythium irregulare

16、 Buisman菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，菌丝发达，不规则分枝，粗1.87.7m，孢子囊梨形、柠檬形，或近球形，顶生或间生，1225（平均23.4）m，藏卵器球形，多间生，偶有顶生，1525（平均20）m，藏卵器壁上常有多个突起。雄器多与藏卵器同丝生，常无柄，卵孢子球形，平滑，单生偶有双生，不满器，1122（平均17.1）m，内含贮物球和折光体各一个。（图6）图7 终极腐霉的形态Fig. 7 Morphology of Pythium ultimum1-3 菌丝膨大体4-5 藏卵器和雄器6 卵孢子标尺=10mPythium ultimum Trow 菌落形态：菌落在CMA上呈放射状，菌

17、丝发达，分枝繁茂，粗3.39.8m，菌丝膨大体近球形，多间生，1432（平均23.4）m，藏卵器球形，平滑，多顶生，少间生，直径1330（平均20）m，雄器多紧靠藏卵器形成，受精管明显可见，粗约1.5m，卵孢子球形，平滑，不满器，1025（平均19.2）m，内含贮物球和折光体各一个。（图7）2.4.2分离腐霉测序结果及同源性比较图8 分离不同地区腐霉菌株基于ITS序列的系统发育树状图Fig.8 Phylogenetic tree based on ITS sequences of Pythium collected from different areas 在形态学鉴定的基础上，用Blast对

18、所分离腐霉菌株的ITS序列与GenBank中已有的ITS序列进行比对，发现大部分腐霉菌株与GenBank中登记的群结腐霉（GQ）、旋柄腐霉（AB）、畸雌腐霉（AB）这3个腐霉种的相似性较高，都在96以上；少数分离腐霉与终极腐霉（AB）的相似性虽然比较低，但遗传距离较其他种要近。本研究未分离、鉴定到其他腐霉种类，分析其原因可能是由于地理区域不同所致。3 结论与讨论研究表明，腐霉是花生根部病害的主要致病菌，它能在苗期侵入，破坏植物的根部，降低植物的抗性，为其他致病菌的侵染提供侵入途径和侵染条件，加剧其他病害的发生。其中尤以群结腐霉为重，Garrren(1966)和孟宪曾(1982)都曾对其有过相关的报道；而近年来有关终极腐霉和畸雌腐霉能引起根腐病的报道屡见不鲜，但在花生根腐病上还未有深入的研究；旋柄腐霉是在此次研究中发现的新致病腐霉，国内外至今仍未有相关的报道，其致病机理有待于进一步的研究。目前，腐霉种类的鉴定仍以形态学方法为主。分子生物学方法虽然也被广泛应用，