DNA合成原理及操作

1、DNA合成原理和工作规范、合成原理、DNA是通过固相酰亚胺三酯法合成的。溶液中的酰亚胺单体通过缩合反应形成3-5磷酸二酯键，连接到固相载体(CPG或裴秀智)。而且，继序列的最后5碱连接后，依次延长，直到合成结束。整个合成过程仪器自动完成，每个周期分为解除保护、激活、耦合、封口(封闭)、氧化五个阶段。第一步：去块：将CPG链核中的DMT保护程序从三氯乙酸(TCA)中移除，并露出五羟基进行下一步的缩合。第二阶段：活化：单体和催化剂溶胶混合在合成器柱中，溶胶将质子转移到3磷酸二异丙胺基的N反应堆中。质子氨是沙唑亲核攻击的出发基团，二病酰胺被沙唑取代，形成了阿因酰胺-沙唑活性中间体。第三阶段：耦合(C

2、oupling):酰胺-四唑中间体是连接到CPG的核苷酸的五期缩合反应，缩合形成通过去除四唑来延长碱基的核苷酸链。第4步：盖帽：少量未反应(2%)的载体中的核苷酸链的5基酸在后续回路中反应，产生碱较少的核苷酸链，因此反应后应关闭。一般使用乙酰化反应和五基缩合成酯结合，一般将乙酸和N-甲基咪唑等混合制成乙酰化药物。步骤5:氧化(Oxidation):结合反应形成的三价磷酸酯结合不稳定，因此，必须用氧化剂碘的四氢呋喃溶液将三价磷氧化成稳定的五价磷。按照这个步骤循环，最终可以得到全长的DNA片段粗体。用新鲜浓氨从载体上切割粗物质，以适当的纯化方式去除片段和氨基脱保护以及乙炔脱保护形成的盐离子。DNA

3、合成工艺，1 .订单接收合成部根据合成实际情况合理分配订单，紧急-排序-内部-外部，等客户尽可能分配和合成，部分长链，G含量高，合成量大的底漆难以合成，时间可能会有些延迟。2.机器合成其他模型的合成器合成，3 .氨解放保护合成完成后，取出载体，切断，保护。通常在40bp以内至少需要2个小时，链条越长，时间越长。4.纯化：目前通用的纯化方式主要是OPC纯化、PAGE纯化、脱盐纯化、HPLC纯化、4.1 OPC纯化、利用OPC主芯的DMT和核苷酸的特殊亲和力，用低浓度有机溶剂清洗无DMT片段，将主芯吸附的DNA清除到酸中后。缺点：纯化是否成功取决于粗DNA的纯度，合成不好的样品在OPC纯化后也可能

4、不纯，随着碱数的增加，纯化效果降低。因为在纯化过程中接触到酸，所以引物容易分解。4.2页纯化利用DNA的不同片段，在胶中的移动率不同，大片段电荷多，分子大，移动速度慢。等目的片段与N-片段分离，切割目的片段，80孵化2小时后脱盐。优点：分离效果好，纯度达98 99%，可满足测序、克隆等。底漆也很稳定。缺点：耗时费力，样品损失大。4.3脱盐纯化，耦合效率高，合成效果好，粗产品本身没有碎片部分，可以直接脱盐。(莎士比亚、脱盐、纯化、纯化、纯化、纯化)优点：消除页面电泳的麻烦，样品回收率高。缺点：无法有效地删除片段。必须合成效果好才能使用这种方法。4.4 HPLC纯化HPLC吸附基质分为逆反热和离子

5、柱。RP(逆柱)根据疏水性的差异进行分离。疏水性强的长片段比片段留在柱子里的时间长。离子柱根据长度不同的寡核苷酸，具有不同的正电荷，慢慢增加流动上的离子强度，先冲洗n-片。优点：纯化效果好，纯度在99%以上，尤其对标记讲义、特殊探针有用。缺点：不能分批生产，需要很长时间，有时样品接收不好，不能有效分离。5 .定量分配样品精制后，冲洗1毫升20%乙腈溶液，260紫外线波长下的测量值，按客户要求分摊，一般所有合成公司基本放大1.2 1.5倍。盆景样品干燥，通过页面抽样检查后送到市场。合成时效：lot primer(计算24个)可在24小时内发运，通常合成20bp左右的primer。OPC纯化：12

6、小时内合成2-3小时氨分解2小时OPC纯化(24批) 1小时定量分1小时萃取1-2小时萃取2小时页面纯化胶2-3小时泡沫胶2小时脱盐0.5小时定量分食1小时萃取2-3小时萃取2小时脱盐精制：12-15小时合成2-3小时氨分解2小时萃取2-3小时脱盐0.5小时定量分食1小时萃取2-3小时萃取2小时如果由于多种原因(例如瓶子溶液丢失或管道堵塞)没有添加到正在扩张的oligo中，下一个反应Capping将密封Oligo，立即停止整个Oligo合成。原因可能是1，Taq酶的原因。因为PCR放大时，讲义也会放大，所以会发生错误，2，化学原因。在合成过程中，如果我们公司提供的DNA合成报告表正确，就意味着

7、合成成功。化学合成的DNA片段比天然DNA片段有更多的碱基突变概率。但是它真正的化学机理还不清楚，但可以肯定的是，要保证100不会出错是不可能的。解决方法：1，高保真Taq酶2，克隆3，匹配引物，DNA损伤烷化鸟氨酸的糖苷结合不稳定，容易在DNA中形成无碱基的部位。2.碱基的物理元素变化：电离辐射会使其他物质形成自由基，导致碱氧化修饰、过氧化物形成、碱环的破坏、脱落等。通常，嘧啶比嘌呤更敏感。化学因素a .甲烷化剂硫酸二甲酯、甲烷磺酸甲酯(MMS)等甲烷化剂，可以将甲烷气加入嘌呤或钨的N或O，使碱化。鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受到攻击，形成m7G和m3A烷基化嘌呤碱，复制时碱基错误配对。

8、例如，瓜氨酸N7可以甲烷化后与T配对，将G-C变成A-T。b .碱类似物5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、2-氨基腺嘌呤(2-AP)等。它们的结构类似于碱基，进入细胞后会代替正常碱基进入DNA链，干扰DNA克隆合成。如果5-BU和T结构相似，则在酮结构中与A配对。它更容易成为Enol结构和G对，在DNA复制中，A-T转换为G-C。c .黄曲霉毒素B，1，2-乙酰化物-氨基芴，苯并芘，黄曲霉毒素等可以插入碱基序列，形成转移码。d .硝酸盐亚硝酸盐使C脱氨变成U，复制后，DNA的G-C可以变成A-T对。碱基的自发变化和损伤A .碱基的异构体相互变化4种碱基的异构体之间可以自发相互

9、变化(烯醇和酮式之间的相互变化)，碱基之间可能会错误配对，产生A-C，T-G等。b .碱基的脱氨基作用碱基的环外NH2有时自发脱落，复制CU、A次黄嘌呤(I)、G次黄嘌呤(X)等时，U-A、I-X、I-C配对，产生子DNA。5-甲胺脱氨基生成T(引起C-GT-A的变化)，C脱氨基生成U(通常被去除或替换为C)。氧自由基损伤细胞代谢副产品O2-、H2O2等，引起碱损伤，产生胸腺乙二醇、羟甲基尿嘧啶等碱修饰物，引起碱对错误。3，碱基插入或美钻失踪记乙炔分子带正电荷，扁平，容易嵌入DNA碱基平面之间，在克隆或重组过程中碱基缺失或插入。DNA聚合酶在复制过程中发生滑动，特别是相同碱基的片段连续丢失或插入一个或多个碱基。聚合酶在模型链上滑动容易消失，在生长链上滑动容易插入。插入或缺失会更改读取框。4，吡啶二聚体DNA暴露在紫外线下，与DNA链相邻的嘧啶通过孔刘结合连接到二聚体。相邻的两个t；或两个c:或可以在c和t之间形成环丁基二聚体。最容易在