动物生理学实验三 鱼类血液涂片制作与血细胞计数

1、血液：由血浆和血球组成的流体组织，具有通过心脏搏动使心血管系统循环流动、运输、防御和免疫，参与维持内环境的相对稳定和体液调节等多种功能。 血液有维持生物体内环境稳定状态的作用，正常情况下，血液中各大姨妈指标处于相对稳定的状态，各指标也能反映一个生物个体的健康程度，因此，血液检查成为疾病检测的最基本技术。 各种各样的血液检查机、血液检查可以辅助疾病的诊断，血液涂膜的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，也是生物测微器的基本方法之一，在临床上的应用极其广泛，特别是对各种血液病的诊断有重要价值。 制备厚度合适、分布均匀、染色良好的血涂膜是血液学检查的重要基本技术。 人体血液涂膜、血液涂膜技术在水产动物

2、疾病检验过程中也起着非常重要的作用，如细菌感染、细小病毒感染以及血液寄生虫疾病的检验等。 目前，这项技术已成为水产技术从业人员的必备技能，也是执行鉴定试验的重点内容。 涂膜经瑞氏-吉姆萨染色液染色后，根据各种细胞球呈现不同的着色，达到了识别其形态特征的目的。 一般细胞球的细胞核都喜欢碱性，被碱性燃料染成蓝色，而胞质溶胶则被酸性燃料染成红色。 血细胞计数法是将少量待测样品的血液混悬剂放置在具有特殊确定面积和容积的载玻片上(也称为细胞球校正板)，在显微镜下直接校正，从血液稀释倍数进一步估计血液中的血细胞数的方法。 鱼类麻醉前后的比较示意、2、准备采集血液的2ml注射器、吸引活塞用肝素金属钍溶液润湿

3、注射器内，准备采集血液。 采集血液采用实验2的采血方法进行，采集的血液保存在离心管1.5 ml中待机。 3、云推送板取边缘光滑的承载板作为云推送板。 将其一端刮取为血滴，迅速使血液均匀地分散到云推送片和载片的接触部位。 然后，将云推送板和承载板置于3040，向另一端顺利挤出，推起涂膜后，放置在空气中使其自然干燥。 (1)将采集的血液滴到幻灯片上，(2)另一张边缘光滑的两凹片倾斜放置在血滴的前缘，先稍微向后移动，轻轻接触血滴，使血液沿着幻灯片的边缘呈线状展开。 (3)两玻璃板的角度优选为30-45，将两凹片轻轻地向前方等速进行，即涂抹在血液薄膜上。 将(4)涂血片、涂不良血片、4、涂血片染色干燥

4、涂血片用甲醇固定35分钟，将固定涂血片放入以ph 6.4-6.8磷酸盐缓冲液稀释10-20倍的吉姆萨染色液中，浸泡5分钟(标本)、清洗后滴少量伊红，染色1分钟直接流水清洗1分钟(请不要丢弃染色液)、涂膜水洗干燥后镜检，涂膜干燥后加入吉姆萨染色液5分钟。 0.1mm是盖玻璃后的校正数室的高度1/400mm2表示校正数室面积为1mm2，分成400个小区，每个小区的面积为1/400mm2。 1、血液稀释以10微升移液器将10微升血液取入新的1.5ml离心管，以1000微升移液器将990微升生理盐溶液吸入(稀释100倍)离心管，轻轻反向搅拌。 2 .修正数板处理用无水乙醇或95%乙醇溶液擦拭修正数板后

5、，用丝布擦拭，再擦拭一片别的盖玻璃，使盖板朝向修正数板上。 3 .充液后将干净的修正数板放在试验机上，将盖玻璃放在修正数板的正中间。 用毛细血管吸收稀释混合后的血球混悬剂，将管尖轻轻地倾斜放置在玻璃罩的边缘上，使血球混悬剂缓慢流出，根据毛细现象自动地流入修正数室内。、4、静置血球混悬剂进入修正数室后，静置23分钟，细胞球不再浮游后，在低倍镜下，在修正数室内观察修正数血球的分布是否均匀，能够修正分布均匀的血球。5、用格拉夫修正数板四犄角旮旯方格(各眼睛分成16个方格)内的细胞球数。 在计数时，只对完整的细胞球进行计数，汇集在一起的细胞球按每一个细胞球进行计数。 在一大方格中，如果细胞球在上线，通

6、常下线细胞球不计算上线细胞球，并且上线细胞球不计算右侧细胞球。 6、计数完成后，必须换算每混悬剂ml的细胞球数。 修正数板的每方格的面积为0.01 cm2，高度为0.01 cm，因此，其体积为0.0001 cm3，即0.1 mm3。 因为1 ml1000 mm3，每格的细胞球数为10000细胞球/ml，所以细胞球混悬剂细胞球数/ml4格细胞球总数/410 000已在订正前被稀释，并可进一步乘以稀释倍数。 血细胞计数换算式： 1625 :校正数40010000100稀释倍数(单位：个/ml) 2516 :校正数4001000080稀释倍数(单位：个/ml )、4移液器的使用5镜下进行校正时，如果方眼中的细胞球分布明