干细胞生物学（成体干细胞）.ppt

1、成体干细胞,成体干细胞是21世纪初生物学的伟大发现,它改变了干细胞的传统理念,20世纪初，Pappenheim等首次提出了成体干细胞的概念。 在胎儿、儿童和成人组织中存在的多能干细胞统称“成体干细胞（Adult stem cell）”。,2001年斯坦福大学的Blau博士等人对成体干细胞提出了一个全新的概念： 成体干细胞是来自许多不同类型细胞（包括已分化细胞）的一种“状态”，这类细胞不仅存在特定组织中，还可通过血液到达躯体的各个部分，参与各种组织的再生和修复。,成体干细胞是指一群分布在组织中尚未分化的、具有增殖、自我更新、分化潜能的细胞，该细胞负有构建和补充某种组织的各种类型细胞潜能。,类型,

2、1、骨髓干细胞,各种血细胞,内皮细胞 脂肪细胞 成纤维细胞,HSC和MSC的分化潜能具有很大的可塑性，可分化为甚至跨越胚层的各种类型细胞，如神经细胞、软骨细胞，骨细胞，干细胞、肌肉细胞等不同类型的细胞,间质干细胞（MSC）,造血干细胞（HSC）,骨髓干细胞,间充质干细胞,间充质干细胞(mesenchymal stem cell , MSC) 是中胚层分化而成的一种非造血成体干细胞,它在体外贴壁生长,在适当条件下可以大量扩增分化为间充质细胞(mesenchyma cell ,MC) ,即间充质祖细胞(mesenchymal progenitor cells , MPC) 间充质干细胞在体外培养时

3、，可分化为内皮细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、软骨细胞、骨细胞、肌肉、血管内皮、成纤维细胞等各种结缔组织细胞等细胞的潜能,造血干细胞 造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。 造血干细胞表面存在一些标志，可用流式细胞仪和免疫磁性分选技术从骨髓细胞中分离和纯化出HSC。 造血干细胞移植到不同的环境可分化为各种不同类型细胞。 造血细胞发挥功能可相对游离，不需“生物支架”、神经、血管、外科移植等复杂的“下游”工艺，因此便于直接应用于临床。 造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性和转移性恶性肿瘤疾病的最有效方法。,造血干细胞（多向性）,原红细胞（定向性

4、）,网织红细胞,红细胞,粒系巨噬定向干细胞,原单核细胞,单核细胞,巨核细胞,血小板,淋巴母细胞,淋巴细胞（6型）,造血干细胞分化示意图,原巨核细胞（定向性）,巨噬细胞,神经干细胞是神经系统中一类能自我更新、并产生神经原和神经胶质细胞的多能细胞。,2、神经干细胞,3、肝干细胞,1958年Wilson等认为肝组织中存在着干细胞，因为肝组织均有营养损伤和部分切除时再生能力。 肝卵圆细胞能在体外大量增殖，细胞移植后可分化为肝细胞和胆管上皮细胞，表明肝卵圆细胞是肝干细胞。,肝干细胞的可塑性,肝干细胞移植到胰腺和十二指肠时可分化胰腺细胞和肠上皮细胞，表明肝干细胞在适当的微环境中能被诱导分化为内胚层的其他组

5、织细胞。 丁酸钠或二甲亚砜可诱导肝干细胞分化为肝细胞 转化生长因子（TGF-bata）或肝细胞生长因子（HGF）可诱导肝干细胞分化为胆上皮细胞,4、骨骼肌干细胞,肌肉的生长、更新和修复是由肌纤维周围的卫星细胞介导的即骨骼肌干细胞 骨骼肌干细胞不仅可分化为肌肉，而且可分化为血液细胞成分。具有分化的可塑性,心肌干细胞： （1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝 （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技术检测L型Ica(L-型钙电流) ，Ina，Ito，Ik，Ik1，Ik，ACH和If （3）基因表达：及心肌球蛋白重链,成体干细胞生物学特

6、征: 成体干细胞注入体内后,有明显的趋化性,较明显地集中到受损伤部位; 成体干细胞到达受损伤部位后,在局部微环境的诱导下,发生明显的诱导分化,使成体干细胞向损伤组织修复所急需的组织细胞分化,从而促进损伤组织的修复。 这个现象,被称为“局部专一诱导性分化”(sitespecific differentiation),成体干细胞横向分化（transdifferentiation）或称为可塑性。 不仅分化为所在组织的细胞，还能跨譜系，甚至跨胚层分化 。 这些细胞可能来源于胚胎发育中停留于各组织的亚全能干细胞，故具有跨胚层分化特点。,三、成体干细胞的鉴定,（1）干细胞的基本特性（包括细胞形态与结构）

7、（2）干细胞特有的表面标记 （3）生化特性 （4）细胞内特异基因的表达 （5）细胞功能鉴定,1、造血干细胞的鉴定： 造血干细胞来源于胚胎期的肝脏和骨髓 （1） 细胞形态 ：呈非贴壁生长，细胞形态较小. （2）细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1；,（3）脾集落技术,Till和McCulloch建立的脾集落技术的具体方法是： 将小鼠经致死剂量射线照射后，由尾静脉输入适当数量的正常同系小鼠造血细胞。若干天后(8-9天)，在受体小鼠的脾脏中生成由造血细胞形成的脾集落，通过对脾集落中的细胞成分及功能等研究来推测造血干细胞的性能

8、。,Till和McCulloch建立的脾集落技术,脾集落生成细胞：生成脾集落的原始细胞。 脾集落大多是由红系、粒系、巨核系细胞或三者混合组成。 人们一般利用一些具有细胞遗传标志的造血干细胞来生成脾集落，根据脾集落遗传标志的情况来研究造血干细胞的性能。,（5）用动物体内实验来验证人类造血干细胞高度自我更新和长期造血重建方法 主要包括： 造血干细胞羊胎内移植； 重症联合免疫缺陷病(SCID)或免疫缺陷(HID)小鼠体内移植；,无胸腺的裸鼠是T细胞选择性缺陷的天然动物模型,2.骨髓间充质干细胞,间充质干细胞（MSC）能向软骨、骨、脂肪、造血基质和神经原样等细胞分化。首选为组织工程中的种子细胞。 MS

9、C主要来源于骨髓，还可来源于脂肪组织吸取物（PLA）,人骨髓间充质干细胞强表达CD29 (-整合素)，高表达CD44（透明质酸受体），表达CD105（SH2），不表达造血干细胞表面标记：CD34、CD45。,细胞排列紧密， 呈漩涡状图（A）。 细胞形态多样, 类似成纤维细胞, 呈异质性， 以长的梭形细胞为主， 也有三角形、多角形和星形细胞， 伸出长短不一、粗细不均的胞质突起。 传代后， 细胞形态趋于同一。 HE染色结果发现胞核大， 核仁15个图（B）,多数BMSCs的细胞核被BrdU所标记， 呈阳性,人骨髓间充质干细胞向成骨分化 1、细胞碱性磷酸酶染色阳性； 2、 骨钙素染色阳性：红色为细胞质

10、所含骨钙素，蓝色为细胞核； 3、 细胞经茜素红O染色，红色部分为钙结节,骨髓间充质干细胞向成脂分化 细胞经油红O染色，着红色部分为脂肪滴,3、内皮干细胞的鉴定 （1）细胞形态：扁平贴壁状态 ；Weibel-Palade小体；广泛胞内连接；大量吞饮泡。 （2）细胞标志：血小板内皮细胞粘附分子PECAM-1或CD31；细胞粘附分子整合素v3 ；CD34 ；JAM(Junctional Adhesion Membrane) ；MECA-32以及MEC-14，7抗原 （3）特异基因表达：flk-1；flt-1 ；tie-2,4、肝干细胞的鉴定,肝干细胞本身缺乏特异性标志，多潜能的肝干细胞同时表达肝细胞

11、和胆上皮细胞的标志物。 细胞角蛋白CK7和CK19为胆上皮细胞特异标志物 白蛋白和肝代谢酶细胞色素P450可作为肝细胞的特异标志物。,现在认为，在胆管树的末梢区域，即相当于组织学上的郝令氏管（canals of Hering）区，存在具有双向分化潜能的上皮细胞，可能是来源于胆小管周围、体积更小的“未定性（nondescript）”间质细胞。 在肝脏严重受损及/或成熟肝细胞的增殖受阻的情况下，它们可以异常激活、增殖，大量出现在肝小叶外周区域，组织学上表现为肝小叶周围体积较小、增殖活跃的细胞群体。,大量增殖的卵圆形细胞沿肝实质向肝小叶中央区迁移，分化成成熟的肝细胞，修复和重建肝脏。 与此同时，卵圆

12、细胞也可以向胆管上皮细胞分化，参与肝内胆管的形成。目前普遍认为，肝卵圆形细胞就是成体肝组织内的干细胞。,（1）细胞结构：细胞内含糖原颗粒，大量线粒体以及广泛的未形成成熟肌原纤维的粗丝和细丝,细胞核质比大，胞核圆形或卵圆形，被称之为肝卵圆形细胞（hepatic oval cells,HOC）. （2）细胞功能：节律性收缩 ；心肌特异离子流。利用膜片钳技术可检测L型Ica，Ina，Ito，Ik，Ik1，ACH和If （3）基因表达：及心肌球蛋白重链 ,白蛋白（ALB）、甲胎蛋白（AFP）和系列细胞角蛋白（CK7，8，9，14，18，19，20),相关的干细胞因子和受体如Thy1、Flt3、SCF/

13、ckit、OV6，髓源性干细胞标志如CD34等,5、心肌干细胞的鉴定,正常肝脏是否存在干细胞尚有争议。有学者基于成熟肝细胞在肝损伤后可以不间断地恢复增殖能力的特点，提出肝脏本身就是一个“干细胞池”的观点。 然而根据干细胞的定义，干细胞除了具备分裂增殖能力以外，还应具备一定的分化潜能。 成熟肝细胞分裂产生的后代细胞仍然是成熟肝细胞，因此从严格意义上讲，成熟肝细胞不应被看作是干细胞。,6、神经干细胞 的鉴定 （1）细胞形态：胞体很小，从胞体伸出许多长的神经突 （2）细胞功能：电压控制性Na+，K+，Ca2+通道；神经递质的受体 （3）细胞标志： nestin ，TH（酪氨酸羟化酶），微管相关蛋白t

14、au，MAP2，微管蛋白3（TuJ-3），GFAP（胶质纤维酸性蛋白），巢蛋白，突触泡蛋白以及NF-L（68KDa的神经丝蛋白），NF-H（200KDa的神经丝蛋白），NF-M（160KDa的神经丝蛋白）；Nurr1 （孤儿核受体1）和Ptx3（中脑多巴胺能神经元的标志）,神经干细胞的分布 神经管形成以前 ,在整个神经板检测到神经干细胞的选择性标记物神经巢蛋白 (nestin),是细胞的骨架蛋白。 神经干细胞主要存在于神经发生区：海马回和次脑室区, 成年嗅球、皮层、室管膜层或者室管膜下层、纹状体、海马的齿状回颗粒细胞下层等脑组织中分布着神经干细胞。研究发现脊髓、隔区也分离出神经干细胞 脊髓损伤

15、时,来自于神经干细胞的神经元新生受到抑制,而神经胶质细胞明显增多,其机制可能与生成神经元的微环境有关。,7、 胰岛干细胞的鉴定 体外培养可形成细胞集落 细胞标志： Nestin阳性 细胞角质蛋白19(CK一19)阴性 胰岛素淀粉样多肽IAPP 葡萄糖转运蛋白-2（ GLUT2 ） ； 表达肝细胞生长因子受体(cMet)，但不表达血管内皮细胞抗原。 胰岛细胞的特征及特定标记物：胰岛GK和GLUT2（葡萄糖转运子）；转录因子IPF1/PDX1和NgN3（Neurogenin3）,二、成体干细胞横向分化的研究方法,证明成体干细胞的横向分化必须符合三个标准： 分化细胞来源于供体干细胞， 分化细胞表型与

16、受体靶器官中的细胞相似， 分化细胞具有与靶器官细胞类似的功能。,成体干细胞实验中供体细胞的追踪,1利用细胞天然存在的标志 不同的细胞，其固有的标志不一样， 如雄性细胞存在Y染色体，不同细胞其等位基因不同，利用供体细胞和受体细胞天然存在的这些标志系统的不同将其区分开。,根据供、受体细胞等位基因的不同，编码的蛋白不一样，用免疫组化或免疫荧光方法检测组织特异性蛋白,或用原位杂交的方法检测细胞类型特异性mRNA的表达，追踪供体细胞 。,2、人工标记 用一些遗传操作手段对供体细胞进行人工标记。如用带半乳糖苷酶（LacZ）报告基因或绿色荧光蛋白(GFP)基因的转基因系统，,（三）供体细胞分化状态的确定 根

17、据细胞的表面标志证实供体细胞是否具有分化能力,（四）供体细胞分化状态功能检测 供体细胞分化成了所需要细胞还不够，关键是这细胞要有功能，因此，需要进行功能检测。,胚胎干细胞和成体干细胞的比较研究,成体干细胞与胚胎干细胞比较,1、胚胎干细胞分化谱系宽，可以建系传代，增殖能力强。 成体干细胞同样具有多分化潜能，但相对较窄. 理论上胚胎干细胞应用前景广阔。,2、免疫排斥的问题 胚胎干细胞存在免疫排斥的问题，而自身成体干细胞不具有这类问题。,3、应用胚胎干细胞移植治疗容易导致畸胎瘤,而成体干细胞没有发现类似情况。,在应用胚胎干细胞治疗前，必须先进行初步的细胞诱导分化，以防止畸胎瘤的发生。 应用胚胎干细胞

18、时，也必须确认胚胎干细胞供者没有遗传性疾病。,成体干细胞和胚胎干细胞各有自身的优势和缺陷。 对于一个实验室而言，同时开展对两者的研究，不仅是可能的，而且能互为裨益，相得益彰。 两者的研究对干细胞领域而言都是必要的。,五、成体干细胞研究中的问题,1、异质性 干细胞的异质性在遗传学中是指由于不同遗传机制而产生的相同或类似的表现型 异质性在某种程度上是干细胞固有的特性。,2、干细胞所处环境,干细胞所处的环境对于干细胞的分化命运有着重要影响。 干细胞与所处的环境之间精巧而默契的协调作用可能是干细胞“可塑性”的重要原因,对于干细胞“可塑性”现象的解释有4种： 1）机体有多种来源和不同分化方向的成体干细胞群体，能分别定向