白腐真菌生物技术与应用

1、课程安排与考核方式,学时数 32学时（包括讨论课时）,白腐真菌 生物学基础 （理论基础）,白腐真菌 生物技术 （应用基础）,白腐真菌在 环境保护中 的作用 （应用实践）,考核方式 闭卷考核,成绩分配 平时占40% ；考核占60%,课程内容简介,1、白腐真菌（white rot fungi）的概念,白腐真菌的概念不是生物学术语，而是一种功能描述的概念,小结,到底什么是白腐真菌？,2、白腐真菌的分类地位与主要种类,2-1 白腐真菌的分类地位,白腐真菌属于真核生物超界。,木腐真菌已知的有16001700种， 大多数是担子菌和子囊菌。,软腐真菌：子囊菌、半知菌 褐腐真菌：大部分属于担子菌 白腐真菌：主

2、要是担子菌，少 数为子囊菌,2-2 白腐真菌的主要种类,已知白腐真菌种类有400多种，研究最为透彻，被称为白腐真菌研究 模式菌种的是黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium burdsal）。,黄孢原毛平革菌的生物学分类地位,黄孢原毛平革菌主要分布在北半球，其无性世代也被称为 多粉侧孢霉（sporotrichum pulverulentum novobranova）。,白腐真菌主要分布于 8个菌属,研究较多，且表现出较强降解能力的菌种有20种,3、白腐真菌的生理特点,白腐真菌是一个庞大的生物家族，各成员的生理特点会表现出很大 的差异。 笼统的谈白腐真菌的生理生化特

3、征和性质，既不现实，也不准确。,黄孢原毛平革菌具有发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，无 锁状联合。多核分生孢子常为异核，担孢子却是同核体。交配系统有同 宗交配和异宗交配。 黄孢原毛平革菌的生长具有营养生长期和子实体生长期。,锁状联合：担子菌的次生菌丝每一个细胞都有二个核，其中一个核来自母 本，一个来自父本，当双核细胞进行细胞分裂时，在二个核之间外生一个短小 弯曲的分枝，核移动，在二核之间生出一个突起如钩状，一个核进入钩，一个 留在菌丝。钩中保留一个核，一个往后移，菌丝中二个核一往前一个往后移钩 状突起向下弯曲与细胞壁接触溶化，分枝基部生分隔膜（分隔中间有孔道）， 在原分支外形成一隔膜，产生

4、一个新细胞双核体，在分隔处保留一个桥形结构。,分生孢子 无性繁殖，通过 菌丝体的裂殖产生。,担孢子 有性繁殖，必须通过菌丝体细胞的 锁状联合过程。,同宗交配和异宗交配,两条可互相交配的单核菌丝融合,只要同一孢子萌发的单核菌丝间的互相结合生出 双核菌丝后，就可形成子实体，这种现象称为同宗交 配。反之，只有异性的单核菌丝（不同孢子），才能 结合成双核菌丝，这种结合方式称为异宗交配。,3-1 白腐真菌的生长与代谢特点（黄孢原毛平革菌）,n-l在木质素降解中的作用: 实质上是白腐真菌在进化过程中对环境中氮缺乏的一种生理适应。 c-l在木质素降解中的作用: 主要是它和菌丝体质量的减少像偶联，从而启动了次

5、生代谢。,与木质素降解有关的几个基本概念,白腐真菌对木质素的降解过程是一个共代谢(cometabolized)过程,木质素,完成降解过程,共代谢的两种方式 1、某种生物将一种底物转化，却无法在这种底物上生长，即生物体 不能利用这种底物氧化所产生的能量去维持生长。 2、一些生物为了共同的效应，共用其生物化学资源，协同作用，对 化合物进行降解。,白腐真菌降解木质素属于何种方式？,小结 3-1,白腐真菌的生长与代谢特点,3-2 白腐真菌在培养中的特点（黄孢原毛平革菌）,这里的培养特指实验室中小规模的,以研究基本规律为目的的培养,接种物,培养方式,静置培养 standing culture,1、尽量采

6、取浅层培养方式； 2、尽量避免菌墊起褶，尤其在培养初期菌墊很薄的时候； 3、氧气的扩散速度是静置培养时决定白腐真菌降解木质素能力的限制性因子；,振荡培养 shaking culture,固体培养体系,白腐真菌的固体培养主要是平板培养，少量进行斜面培养。,平板培养的目的： 扩大菌的生物量或是大量获得孢子； 鉴定菌的酶活性 或扫描菌对化学物质的降解能力； 用于菌种的分离筛选、 诱变、驯化或是短期的保藏； 斜面培养的目的：菌种的中、长期保藏；,3-3 环境因子对白腐真菌代谢活动的影响（黄孢原毛平革菌）,涉及的环境因子或培养条件包括： 培养基成分； 活性添加成分； 氧； ph； 温度,培养基成分,实验

7、培养最佳碳源为葡萄糖,有机酸,表面活性剂,有机酸，如甘醇酸（glycolate）、乙醛酸（glyoxylate）、草酸（oxalate） 等，可以促进木质素降解活动。其中，草酸的作用尤其引起重视，草酸具有刺 激锰过氧化物酶及调节细胞外酸碱度的功能。,白腐真菌液体培养体系中加入表面活性剂可以有效地保护木质素降解酶免 受因机械剪切力所造成的结构破坏或活性丧失。 最为常用的表面活性剂tween 80（吐温80）,4、白腐真菌酶学简介,4-1 白腐真菌主要酶种概述,h2o2产生酶系,共同作用：以小分子有机物为底物，将分子氧化还原为h2o2。,葡萄糖氧化酶 细胞内合成分泌到细胞外环境，将糖类物质氧化还原

8、为h2o2。 乙二醛氧化酶 为细胞外的含铜氧化酶，主要以醛类物质为底物。而醛类物质 恰好是葡萄糖氧化的中间产物。 其他酶 参与h2o2的产生。主要有甲醇氧化酶，va氧化酶等。,木质素过氧化物酶（lip）的分离和检测,lip的分离,4-2 主要木质素降解酶的分离、提纯和检测方法,lip的标准检测方法,锰过氧化物酶（mnp）的纯化和检测,mnp的纯化,所有纯化步骤在4进行，通过上述方法制备的酶制品可以保存1年不失活,mnp的基本测定方法,利用各种芳香族底物，在补充锰（）离子的条件下，均可进行mnp的测定。,表 用于mnp测定的底物及相关波长数据,mnp的基本测定方法具体步骤,1ml反应混合液,0.

9、1mmol/l酒石酸钠 （ph 5.0）,0.1mmol/l底物,0.1mmol/l mnso4,适量的酶液,光程1cm、体积1.5ml 石英比色皿，室温,加入0.1mmol/l h2o2,以不加h2o2的反应体系为对照； 1u为每分钟氧化1微摩尔每升底 物的mnp；,启动反应,mnp其他具有代表性的测定方法还包括abts氧化法，mn()氧化法和酚红法。,漆酶（lac）的定性和定量检测方法,lac的定性检测方法,lac的定量检测方法,愈创木酚法：在含0.02%（质量浓度）愈创木酚的平板上可以鉴定细胞 外液中lac的活性，lac催化愈创木酚聚合形成红棕色的区带。,1mmol/l愈创木酚,50mm

10、ol/l乙酸钠 ph4.5,适量的酶液,37，5分钟,465nm处测定吸光度,一个酶活单位定义为每分钟引起波长465nm处吸光度一个0.01单位变化所需的酶液量。,5、白腐真菌分子生物学简介,黄孢原毛平革菌的分子生物学,其他白腐真菌的分子生物学,木质素降解过氧化物酶的分子生物学,未来发展趋势：破解各类白腐真菌基因图谱,6、白腐真菌的生物降解,6-1 白腐真菌生物降解的特点,6-2 白腐真菌生物降解系统,白腐真菌生物降解系统的概念,白腐真菌生物降解系统的组成,6-3 白腐真菌生物降解的机制,木质素的降解机制,木质素的主要种类,木质素的降解过程,化学物质的降解机制,氧化机制 包括lip和mnp的过

11、氧化物酶，利用h2o2促进化学物质发生单电子氧化形成自由基。,单苯化合物,苯、甲苯、乙苯和二甲苯（分别简称为b、t、e和x，合称btex），是一类重要的 有机污染物。,白腐真菌对这类有机污染物质的降解效果，从底物的敏感性来排序： etxb （乙苯甲苯二甲苯苯）,氯酚,氯酚是污染物的大类，也是造纸废水的主要成分。白腐真菌主要降解五氯苯酚 （pcp）、单氯苯酚（cp）、二氯苯酚（dcp）和三氯苯酚（tcp）。,联苯,联苯类物质由于疏水性和稳定性，在环境中可以长期存在，对人及各种生物构成 毒性。白腐真菌主要降解多氯联苯（pcb）和联苯。,硝基芳烃化合物,硝基芳烃化合物是合成许多工业化学物质的重要原料

12、。白腐真菌主要降解2,4,6-三 硝基甲苯（tnt）和2,4-二硝基甲苯。,杂环化合物,杂环化合物大多数属于雌性荷尔蒙类物质，对人体危害极大。白腐真菌主要降解噻嗯 类和二恶英类。,氰化物,氰化物是优先污染物，作为lip的一种底物，在h2o2存在时，能被白腐真菌迅速 矿化为co2。,杀虫剂,白腐真菌主要降解ddt和有机磷杀虫剂。,除草剂,白腐真菌主要降解2,4,5-三氯苯氧乙酸。,卤化物,白腐真菌对于有机类卤化物具有脱卤作用。,塑料及聚合物,白腐真菌主要降解木素-聚苯乙烯接枝共聚物，聚乙烯塑料和聚酰胺。,挥发性有机物,白腐真菌对9种在排放的工业废气中普遍存在的挥发性有机物（voc）具有降解 能力

13、。包括芳烃类（苯、甲苯、乙苯、苯乙烯）、酮类（甲乙基酮、甲基异丁基酮、 甲基丙酮）、有机酸类（乙酸丁酯、乙基-3-乙氧基-丙酸酯）。,煤,主要是针对低级煤（lrc），对其进行液化、解聚、聚合和脱色。,pah,多环芳烃（pah）是重要的环境污染物，危害极大。白腐真菌主要降解蒽油、芘、 苯并芘、蒽、菲等pah类物质。,染料,白腐真菌主要降解偶氮染料、三苯甲烷染料、聚合染料、杂环染料和靛类染料，几 乎包括了染料的所有大类。,6-5 白腐真菌生物降解的优点,白腐真菌的生物降解具有其他生物体系，尤其是细菌体系，所不具备的优点， 共有六大优势。,1、不需要进过特点底物的预条件化； 2、动力学优势； 3、对

14、其他微生物的拮抗； 4、细胞外的降解特征； 5、降解底物的非特异性； 6、适用于固液两种体系；,6-6 白腐真菌生物降解的意义,白腐真菌在碳素循环中的地位和作用,白腐真菌是生物修复的有力工具,白腐真菌在物质转化和资源利用中的应用,白腐真菌生物技术的特点： 1、复杂性：条件的复杂性以及调控和操作的复杂性； 2、综合性：生物学问题、化学问题和环境问题的结合；,1、白腐真菌培养技术,白腐真菌生长及保存培养基,液体培养基,平板培养基,试管培养基,保存培养基,生长培养基,几点说明： 培养基的ph值，一般保持在5.5左右； 将固体培养基分装在试管里，做成斜 面，主要供菌种保存用； 将固体培养基倾入培养皿，

15、制作平板， 主要供菌种扩增和获得分生孢子、菌琼脂 块等接种物； 不加琼脂，即配制成液体生长培养基， 主要为菌种的扩增和获得收集菌丝体用；,主要培养基种类,菌种的保存,接种物的制备,琼脂块 主要是那些不形成分生孢子的菌种的接种物。 方法：从生长旺盛的平板边缘，切割0.51.0cm见方的琼脂块。,菌丝体,孢子活力的测定,使用美蓝染色法测定白腐真菌分生孢子的存活率。,2、白腐真菌的分离技术,2-1 木腐担子菌的分离与筛选,技术步骤：担子菌筛选鉴定菌的木质素降解能力,技术核心：从自然环境的固体介质的混合微生物群体中，将木腐或白腐 担子菌分离筛选出来。 基本思路：建立选择培养基，在固体的分离培养基中加入

16、一些对其他类 别微生物的抑制剂。 基本步骤：,以黄孢原毛平革菌的分离为例,担子菌的筛选,利用选择培养基初步分离担子菌类（粗筛）,2-2 具有降解异生物质能力的白腐真菌的筛选,筛选的必要性,白腐真菌对异生物质的降解长期以来集中在黄孢原毛平革菌，但是在实际应用过程 中其木质素降解条件很难得到满足。因此，筛选能在较宽泛环境条件下降解异生物质的 白腐真菌对于应用技术的开发具有重要意义。,筛选的基本策略,理想的筛选方法，既要便宜，建立在相对无毒的底物基础上，不依赖于烦琐的分析 之上，同时它应该与木质素降解酶所调节的异生物质的降解有高度的相对应性。,利用聚合染料的筛选程序（常用）,2-3 白腐真菌木质素降

17、解性能的鉴定,白腐真菌木质素降解酶的平板定性,白腐真菌木质素降解能力的平板鉴定,这是一种快速评价白腐真菌木质素降解能力的平板方法。,3、白腐真菌反应体系的建立,建立白腐真菌反应体系需要考虑的基本因素（6大因素）,培养基,为防止培养基的微生物污染可以考虑在培养基分装前或是培养5天后加入20u/ml 青霉素或是2mg/ml链霉素，不会影响木质素过氧化物酶的产生。,供氧,4、白腐真菌的固定化（immobilizayion）技术,琼脂糖和琼脂小珠,包埋法,细胞或酶的包埋是生物固定化中最常用的方法。 基本原理是将生物材料包裹和埋藏在水不溶性的凝胶聚合物的网络骨架中。 用于包埋的凝胶聚合物，分为天然的高分

18、子多糖类物质和合成的高分子化合物两大类。,将白腐真菌的孢子包埋于琼脂糖胶和琼脂胶小珠内，制备方法如下：,海藻酸钙小珠,方法一,方法二,k-卡拉胶颗粒,条件优化与改进： 以生理盐水为溶剂，卡拉胶浓度为3%（质量浓度），常规菌量的1/2， 在2%（质量浓度）的kcl溶液中交联2h，切成小块。,明胶包埋小块,pva包埋法,pva，聚乙烯醇，相对分子质量7700079000，为人工合成的高分子化合物。,pva包埋最常用的是pva-硼酸法,白腐真菌包埋技术初探,环本053 姚晶晶,研究背景,白腐真菌处理有机固体废物时存在问题，即 降解效率低 ，产生机械剪切力 白腐真菌包埋技术能解决问题，防止机械剪 切力

19、的产生,目的,通过对白腐真菌菌剂的复活率、保存效果和制备成本的比较来选择制备白腐真菌菌剂的优势载体。,为白腐真菌处理有机固体废物时减少杂菌感染率,寻求一种最佳的白腐真菌包埋手段。,实验用微生物菌种 香菇（lentinus edodes）： 购自浙江省庆元县食用菌科研中心 黄孢原毛平革菌（phanerochaete chrysosporium）： 购自中科院微生物菌种保藏中心 凤尾菇（pleurotus pulmononanus）： 购自浙江省庆元县食用菌科研中心 平菇 （pleurotus ostreatus）： 购自浙江省庆元县食用菌科研中心,纯培养的白腐真菌菌丝体,结果及分析,白腐真菌菌剂

20、的感观,四种白腐真菌菌剂的外观形态,pva包埋小珠色泽透明、弹性度强是最优选菌剂，k卡拉胶包埋 小珠湿度较大处于劣势地位。,白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况黄孢原毛平革菌,用pva对黄孢原毛平革菌进行包埋在本次实验中复活率最快，生长更浓密。,白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况香菇,香菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和pva小珠包埋法。,白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况 凤尾菇,凤尾菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋法和pva小珠包埋法。,白腐真菌菌剂菌丝体的生长状况 平菇,平菇的特性适合海藻酸钠小珠包埋方法、pva小珠包埋法、明胶小珠包埋法和k卡拉胶小珠包埋法。,k卡拉胶,pva,明胶,钠酸藻海,白腐真菌菌剂的保存

21、效果 感观变化（30天）,k卡拉胶包埋小珠的湿度变大，保存效果较差,白腐真菌菌剂的保存效果复活率黄孢原毛平革菌,四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。,菌丝体生长长度（cm）,培养时间（d）,白腐真菌菌剂的保存效果复活率香菇,四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。,菌丝体生长长度 （cm）,培养时间（d）,白腐真菌菌剂的保存效果复活率凤尾菇,四种包埋小珠的复活率不随着保存时间的延长而下降。,菌丝体生长长度（cm）,培养时间（d）,白腐真菌菌剂的保存效果复活率平菇,k卡拉胶包埋小珠的复活率随着保存时间的延长而下降。,菌丝体生长长度（cm）,培养时间（d）,四种材料的制备成本比

22、较,制备成本分析,本实验包埋150mg干重的白腐真菌所需的海藻酸钠和k-卡拉胶各需 2g，明胶3g，聚乙烯醇（pva）3.8g，此外pva包埋时为防止粘交，要 加入0.38g海藻酸钠。,海藻酸钠小珠包埋法是最便宜实惠的包埋方法，pva包埋法次之， k-卡拉胶包埋法是这四种包埋法中花费最多。,本研究结果证明：最适合白腐真菌包埋的方法是 海藻酸钠小珠包埋法和pva小珠包埋法。 综合结果表明：在白腐真菌处理有机固体废物时， 海藻酸钠小珠包埋法是最适合选择。,总结,吸附法,利用微生物和载体（support）之间的吸附能力，将微生物结合在载体表面，形成 微生物-载体复合物，这种固定方法称为吸附法（ads

23、orption）； 常见载体包括：尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃、多孔陶瓷、聚丙烯等，其 中尼龙网、聚氨酯泡沫、硅管、烧结玻璃较为常用；,聚氨酯泡沫小块,共固定,共固定是固定化技术的新发展。它是将各种酶、微生物细胞和底物，共同固定在一个综合体系中， 实现酶促反应和新陈代谢的共同作用或相互反应。 共固定的优点在于建立了一个综合工艺： 将关键生物共同固定在一个特定体系中，避免过剩性 或抑制性的生物转化； 使在催化功能上有联系的生物物种在空间上接近，导致了高产率。 共固定的方法，可以通过吸附、包埋和胶囊化等，将多种生物催化剂固定在同一反应体系中。应 选择表现出种间共生、偏利共生或互惠共生的种，进

24、行固定混合培养。,1、白腐真菌和水污染控制,白腐真菌应用于污染处理的最初和最多的实践，是在水污染控制领域。,制浆造纸废水处理,废水特点：含有大量木质素和氯化木质素的难降解化学物质以及大量色素类成分， 导致了废水的高色度和难降解性。,处理原理：利用白腐真菌对木质纤维素类物质的降解能力，同时利用白腐真菌作用 所导致的废水脱色反应。 木质素及其降解衍生物是废水的主要致色成分，脱色的本质是由于白腐真菌对 木质素及相关化合物代谢的结果。,制浆造纸废水一般处理工艺,1、整个工艺以rbc生物反应器为基础，不需要无菌条件； 2、工艺产生的剩余污泥，富含纤维素、矿物质和氮源物质可以作为培养白腐真菌的营养物；,橄榄油生产废水一般处理工艺,以活性污泥法为基础的处理工艺,军火工业废水处理,废水特点：红色、高毒性，含高浓度硝基芳烃类化合物发生光化学反应而产生。,处理原理：利用白腐真菌对硝基芳烃类化合物降解作用。,军火工业废水一般处理工艺（生物-活性炭工艺）,（1）预处理；（2）生物处理；（3）泥水