水处理微生物学课件-6

1、内容提要： 1.微生物生长繁殖的概念 2.微生物生长繁殖的测定方法 3.微生物的典型生长曲线及不同时期的特点 4.微生物的连续培养方法和应用,第七章 微生物的生长繁殖,生物个体物质有规律地、不可逆增加，导致个体 体积扩大的生物学过程。,生长：,生物个体生长到一定阶段，通过特定方式产生新的 生命个体，即引起生命个体数量增加的生物学过程。,繁殖：,生长是一个逐步发生的量变过程， 繁殖是一个产生新的生命个体的质变过程。,在高等生物里这两个过程可以明显分开，但在低等特别是在单细胞的生物里，由于细胞小，这两个过程是紧密联系又很难划分的过程。,微生物生长繁殖的相关概念,发育：微生物的生长与繁殖是个交替过程

2、，从生长到繁殖的量变到质变的过程是发育。 群体生长个体生长+个体繁殖 可以用重量、体积、群体浓度或密度指标来测定。,一般微生物的研究和应用中，只有群体的生 长才有意义，所以通常讲的“生长”是指群体生长。,一个微生物细胞,合适的外界条件，吸收营养物质，进行代谢。,如果同化作用的速度超过了异化作用,个体的生长 原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加,如果各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就 会发生繁殖，引起个体数目的增加。,群体内各个个体的进一步生长,群体的生长,（1）概念 细菌两次细胞分裂的时间间隔。 （2）影响 正常情况下，世代时间稳定 世代时间受培养环境的影响。 不同的微生

3、物，生长繁殖速度不同，世代时间也有不同。 一般，原核微生物的繁殖速度大于真核微生物。好氧微生物快于厌氧微生物。,2.世代时间,第一节 微生物的纯培养,一、纯培养的定义,微生物在自然界中都是混杂地生活在一起。要想研究或利用某一种微生物，必须把它众混杂的微生物类群分离出来，以得到只含有一种微生物的培养。 微生物学中将在实验条件下，从一个细胞或同种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。,二、纯培养的分离方法,平板划线分离法 稀释倒平板法 单孢子或单细胞分离法 利用选择性培养基分离法,（一）平板划线分离法,用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，微生

4、物细胞数量将随着划线次数的增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。,（二）稀释倒平板法,先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如10、100、1000、10000倍），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出出菌落。稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。,（三）单孢子或单细胞分离法,采取显微分离法从混杂

5、群体中直接分离单个细胞或单个孢子进行培养以获得纯培养。 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的 微生物如藻类、原生动物容易，个体较小的细菌较难。 对操作技术有比较高的要求，多限于高度专业化的科学研究中采用。,（四）利用选择性培养基分离法,各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。 另外，还可以将样品预处理，消除不希望分离到的微生物。如加温杀死营养菌体而保留芽孢，过滤去除丝状菌体而保留单孢子。,微生物纯培养分离方法的比较,测生长量,直接法 间接法,测体积 称干重,含氮量

6、 生理指标法 （耗氧量，酶活性等）,三、微生物生长繁殖的测定方法,1、 生理指标法,微生物的生理指标，如呼吸强度，耗氧量、酶活性、 生物热等与其群体的规模成正相关。 样品中微生物数量多或生长旺盛，这些指标愈明显， 因此可以借助特定的仪器如瓦勃氏呼吸仪、微量量 热计等设备来测定相应的指标。,常用于对微生物的快速鉴定与检测,2、计数器计数法,缺点： 不能区分死菌与活菌； 不适于对运动细菌的计数； 需要相对高的细菌浓度； 个体小的细菌在显微镜下难以观察；,3、平板菌落计数法,样品充分混匀；,每支移液管及涂布棒只能接触一个 稀释度的菌液；,同一稀释度三个以上重复,取平均值；,每个平板上的菌落数目合适，

7、便于 准确计数；,一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用 菌落形成单位（colony forming units， CFU）来表示，而 不是直接表示为细胞数。,4、液体稀释法,主要适用于只能进行液体培养的微生 物，或采用液体鉴别培养基进行直接 鉴定并计数的微生物。,对未知样品进行十倍稀释，然后根据估算取三个连续的稀释度 平行接种多支试管，对这些平行试管的微生物生长情况进行统 计，长菌的为阳性，未长菌的为阴性，然后根据数学统计计算 出样品中的微生物数目。,5、比浊法,在一定波长下，测定菌悬液的光密 度，以光密度(optical density, 即O.D.) 表示菌量。,实验测量时应

8、控制在菌浓度与光密度 成正比的线性范围内，否则不准确。,一、培养方法 分批培养：将少量细菌接种于一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活细菌数目或重量的变化。 连续培养：流入新鲜培养基的同时不断流出培养物的培养方式，即一方面连续进料，另一方面又连续出料的培养方式,第二节 微生物的生长曲线,二、细菌的生长曲线 将少量菌种接种在适当的液体培养基中培养，隔一定时间取样，计算菌数，以菌数的对数为纵坐标，生长时间为横坐标作图。,典型生长曲线，只适用于单细胞微生物如细菌和酵母菌，对于丝状生长的真菌或放线菌，只能获得非典型的生长曲线,典型生长曲线 细分：停滞期(适应期)、加速期、对数期、减

9、速期、静止期、衰 亡期 粗分：停滞期(适应期)、对数期、静止期、衰亡期。,1. 停滞期 又称适应期，指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。,为什么会出现停滞期呢？,适应环境（合成相应的酶） 营养储备（用于复制合成）,“万事开头难”,（一）特点 生长速率常数等于零 细胞形态变大或增长 细胞内RNA尤其是rRNA含量增高， 原生质呈嗜碱性 合成代谢活跃 对外界不良条件反应敏感,（二）影响停滞期长短的因素 接种菌龄：接种龄即“种子” 的群体生长年龄，亦即它 处在生长曲线上的哪一个阶段。实验证明，如果以对数期接种龄的“种子”接种，则子代培养物的停滞期就短。 接种量

10、：接种量的大小明显影响停滞期的长短。（基数大） 营养：营养丰富培养基中停滞期短；营养贫乏培养基中停滞期长。,2. 指数期 又称对数期，是指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期。,（一）特点 生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的代 时G或原生质增加一倍所需的倍增时间最短； 细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀； 酶系活跃，代谢旺盛。,指数期的微生物可作为代谢、生理等研究的良好材料，是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄。,（二）指数生长公式,Nx= N02n LgNx=lgN0+nlg2 n =（lgNx-lgN0 )/lg2 =(lgNx-lgN0)/0.3

11、01 G = (tx-t0)/n,t0 tx,NX N0,（三）影响指数期的因素,菌种： 不同菌种的代时差异极大 营养成分：营养越丰富，代时越短 营养物浓度：影响微生物的生长速率和总生长量 培养温度：影响微生物的生长速率,是代谢、生理研究的良好材料 是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄 G染色鉴定时采用此期微生物,（四）指数期的应用,3. 稳定期 又称静止期或最高生长期。 (一) 特点 细胞数目不增加，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中 菌体产量达到了最高点，而且菌体产量与营养物质的消耗间呈现出一定的比例关系 细胞长、大 对不良

12、条件敏感，抵抗力降低 形成糖原、异染颗粒等贮藏物 多数芽孢杆菌开始形成芽孢 有的微生物开始合成抗生 素等次生代谢产物,（二）稳定期到来的原因 营养物尤其是生长限制因子的耗尽； 营养物的比例失调，例如CN比值不合适等； 有害代谢产物的累积； pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜。,生产菌种的发酵厂在稳定期初期收获菌体或代谢产物。 此外，由于对稳定期到来的原因进行研究，还促进了连续培养技术的设计和研究。,（三）稳定期的应用,（一）特点 个体死亡的速度超过新生的速 度(繁殖数死亡数)，整个群 体就呈现出负生长 细胞形态多样，例如会产生很多膨大、不规则的退化形态 利用贮藏物进行内源呼吸，发生自溶 有

13、的微生物在这时产生或释放对人类有用的抗生素等次生代谢产物 在芽孢杆菌中，芽孢释放往往也发生在这一时期,4.衰亡期,主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡。 营养物耗尽，细菌利用贮存颗粒进行内源呼吸造成自身溶解； 有毒代谢物积累，抑制细菌生长等。,（二）衰亡期的原因,与菌种的遗传特性有关: 有些细菌的培养经历所有的各 个生长时期，几天以后死亡，有些细菌培养几个月乃至 几年以后仍然有一些活的细胞； 与营养物质和有毒物质有关：补充营养和能源，以及中 和环境毒性，可以减缓死亡期细胞的死亡速率，延长细 菌培养物的存活时间。,（三）影响衰亡期的因素,

14、两种连续培养方式： 恒浊连续培养 恒化连续培养,三、细菌的连续培养,测定所培养微生物的光密度值,自动调节新鲜培养基流入和培养物流出培养室的流速,使培养物维持在某一恒定浊度,当培养室中的浊度超过预期数值时，流速加快，使浊度降低； 当培养室中的浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；,恒浊培养器的工作精度是由光电控制系统的灵敏度来决定的,如果所用培养基中有过量的必需营养物，就可以使菌体维持最高的 生长速率。,1.恒浊连续培养,维持培养液中细菌的浓度恒定，以浊度为控制指标的培养方式。,设备：恒化器 是一种以恒定流速进水，以相同速率流出代谢产物，使细菌始终在低于其最高生长速率条 件下进行生长繁殖的一

15、种 连续培养装置。 通过控制某一种营养物的 浓度，使其始终成为生长 限制因子的条件下达到的。,2.恒化连续培养,维持反应器中营养物质浓度基本不变的连续培养方式。,在连续培养中，微生物的生长状态和规律与分批培养不同，往往是处在相当于分批培养中生长曲线的某一生长阶段。 如：废水生物处理的连续运行过程中，活性污泥中的微生物处在相当于分批培养生长曲线的生长阶段：加速期或对数期，或静止期或衰亡期。,3.连续培养微生物的生长规律,四、细菌生长曲线在废水生物处理中的应用,在废水生物处理的连续运行过程中，活性污泥中的微生物只是处于间歇培养曲线的某一生长阶段。 对数期：微生物活力强，但不易凝聚和沉淀 ；有机物出 水浓度相对较高。 静止期：污泥代谢活性和絮凝沉降性能均较好。 衰亡期：有机物含量低，BOD5/CODCr小于0.3的废水，用 延时曝气法。,常规活性污泥法：利用静止期； 生物吸附法