第06章 细胞破碎技术与设备.ppt

1、第6章 细胞破碎技术与设备,6.2 Cell Wall 细胞壁,6.1 Summary 概述,6.3Methods and Machines 细胞破碎方法与设备,6.1 Summary 概述,生物分离的第一步是将生物机体从发酵液中分离，通常使用过滤和离心等方法。 发酵细胞的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，还有许多是存在于细胞内部。,对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步纯化的出发原液， 对于胞内产物，则需首先收集菌体，进行细胞破碎，使代谢产物转入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 大多数情况下，抗生素、胞外酶、一些多糖及氨基酸等目标产物存在于在发酵液中。,使胞

2、内产物释放出来一般需要破碎细胞壁。细胞破碎的方法在生物化学领域中得到了很广泛的运用，但多数在小规模生产中，在大规模生产尤其是基因工程中应用极少。,6.2 Cell Wall 细胞壁,一、细胞壁的组成和结构,细胞破碎是为了破坏细胞外围使细胞内含物释放出来。 生物的细胞外围通常包括细胞壁和细胞膜。 细胞膜使细胞内外保持一定的浓度差，它主要由蛋白质和脂质组成，强度比较差，易受渗透压冲击而破碎。 植物和微生物细胞有细胞壁，细胞壁维持细胞坚固。细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁。,1、细菌的细胞壁,几乎所有细菌的细胞壁都是由坚固的骨架肽聚糖组成，是聚糖链借短肽交联而成，使细胞具有一定的形状和强度。 短肽一般

3、由四或五个氨基酸组成，如L丙氮酸D谷氨酸L赖氨酸D丙氨酸。而且短肽中常有D氨基酸与二氨基庚二酸存在。 聚糖键是N乙酰葡萄糖胺和N乙酰胞壁酸交替地通过（l4）位联接而成。短肽接在N胞壁酸上，相邻的短肽又交叉相联，形成了网状结构。,革兰氏阳性菌的细胞壁较厚（1550 nm），肽聚糖占40一90，其余是多糖和磷壁酸。 革兰氏阴性菌的肽聚糖层较薄（1.52.0nm），最外面还有一较厚的外壁层（810 nm），外壁层主要由脂蛋白，脂多糖组成。 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肤键的数量和其交联的程度，如果交联程度大，则网结构就致密。,2、酵母菌的

4、细胞壁,酵母细胞壁的主要成分为葡聚糖与甘露聚糖以及蛋白质等，比革兰氏阳性菌稍厚，面包酵母的细胞壁厚度约为70 nm，而且其厚度随菌龄增加而增加。 与细菌细胞壁一样，破碎酵母细胞壁的阻力主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。,3、其他真菌的细胞壁,大多数真菌的细胞壁主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。不同的真菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数真菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成。 与酵母和细菌的细胞壁一样，真菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。,4、细胞壁的结构与细胞破碎,为了破碎细胞，必须克服的主要阻力是网状

5、结构的共价键。 在用酶法或化学法来溶解细胞壁时，细胞壁的结构和组成显得特别重要，可用来作为选择溶菌酶和化学方法的依据。,二、细胞及其内含物,1、原核细胞 典型的细菌细胞结构主要包括核区、胞质层，胞质外层。 胞质外层有三层： 最外层约8mm厚，酶大多数镶嵌在这层膜上。 革兰氏阳性原核生物缺少最外层结构，但有第二层肽聚糖层和胞浆空间。 第三层为浆膜层或内膜层，革兰氏阴性菌和革兰氏阳性都有这一结构，该层主要由磷脂组成，还有分散的蛋白质分子和金属离子。,，,structure of microbial membranes 细胞膜结构,这三层有不同功能。外层及肽聚糖层使细胞有一定的机械强度；浆膜层和细胞

6、内膜控制细胞的渗透压，即将营养物质运送到细胞内，将代谢物排出胞外。 细胞膜内部包含的物质称为细胞质，它是一种液态的溶液，溶有很多盐、糖、氨基酸和生物大分子（pro. 酶、DNA、脂质等） 。,真核细胞具有真正的细胞核，其结构要比原核生物复杂的多。和原核细胞一样，真核细胞也具有一层细胞膜。 除了细胞膜，真核细胞具有一些有特殊作用的细胞器。 植物和大多数真菌具有细胞壁。,2、真核细胞,动物细胞模式图,植物细胞模式图,6.3Methods and Machines 细胞破碎方法与设备,一、破碎方法分类,1、机械法 主要通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法，常用的器械有组织捣碎机、匀浆器、研钵和研磨

7、、压榨器等。,2、物理法,主要通过各种物理因素使组织细胞破碎的方法。常用的方法有： （1）反复冻溶法 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。 方法：将待破碎的细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 特点：此法适用于组织细胞，多用于动物性材料，对微生物细胞作用较差。,（2）急热骤冷法 将材料投入沸水中，维持85-90分钟，至水浴中急速冷却，此法可用于细菌及病毒材料。,3、化学法,这些方法中，化学法较温和，细胞破坏后产物也不会不可逆的变性，规模也容易放大，生产中最常用。机械法剪切力破坏较大

8、，产生热量，而且不容易规模放大，但设备较成熟，也常用；物理法处理量少，只用于实验室。,二、机械破碎法及设备,机械破碎方法的处理量大，破碎速度较快。采用这些方法，细胞受到由高压产生的高剪切力，但在大多数情况下要采取冷却措施，以便除去由于消耗机械能而产生的过多热量，防止生化物质破坏。,1、珠磨机,（1）机械研磨法的原理及特点 原理：研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。 特点：其主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。,（2）珠磨机的结构及工作原理,工业生产可以采用高速珠磨机。在这种设备中，

9、由于圆盘的高速旋转，使细胞悬浮液和玻璃珠相互搅动，细胞的破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料的滚动而引起的。 珠磨机的结构形式有多种。一般由珠磨室（腔）、搅拌器、电动机及传动装置、冷却剂系统、分离器等组成。,WSK卧式高效全能珠磨机,ZM系列卧式密闭珠(砂)磨机,（3）影响破碎效果的因素,影响因素：珠体的直径、进入珠磨机的细胞浓度、料液的流速、搅拌器的转速和构型、温度等。 珠体的大小：应根据细胞大小和浓度以及在连续流动的操作过程中不使珠体带出来选择。,（3）影响破碎效果的因素,珠体的装量：影响破碎程度和所需能量。 搅拌速度：增加搅拌速度能提高破碎效率，但过高的速度反而会使破碎率降低，能量消耗增大，

10、所以搅拌转速应适当。,2、高压匀浆器,（1）高压匀浆法的原理 工作原理：采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法。利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，并射向撞击环上，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂。 存在的问题：较易造成堵塞的团状或丝状真菌，较小的革兰氏阳性首以及有些亚细胞器，质地坚硬，易损伤匀浆阀，也不适合用该法处理。,（2）高压匀浆器的结构,由可产生高压的正向排代泵（positive displacenemt pump）和排出阀（discharge valve）组成，排出阀具有狭窄的小孔，其大小可以调节。,（3）影响因素及操作方法,影响破碎的主要因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数

11、。 在操作方式上，可以采用单次通过匀浆器或多次循环通过等方式，也可连续操作。 在工业规模的细胞破碎中，对于酵母菌等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞，常采用多次循环的操作方法。,3、Xpress法,工作原理：将浓缩的菌体悬浮液冷却至25至30形成冰晶体，利用500 MPa以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。 特点：主要用于实验室中。该法对冷冻融解敏感的生化物质不适用。,5、超声破碎法,工作原理：利用超声波振荡器发射的15-25kHz的超声波处理细胞悬浮液，由于超声波的空化作用而使细胞破碎。 特点：超声波振荡容易引起温度的

12、剧烈上升，操作时可以在细胞悬浮液中投入冰或在夹套中通入冷却剂进行冷却。,超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及首种类型等因素有关。 超声波振荡器以可分为槽式和探头直接插入介质两种型式。 结构组成：超声波发生器、探头、机架、液槽、控制系统等。 应用：超声波破碎在实验室规模应用较普遍，处理少量样品时操作简便，液量损失少。,三、非机械方法,许多种非机械方法都适用于微生物细胞的破碎，包括酶解、渗透压冲击，冻结和融化、热处理、化学法溶胞等，其中某些方法的应用是有限制的。,1、酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶、 -1，3-葡聚糖酶、 -1，6-葡聚糖酶

13、、 蛋白酶、 甘露糖酶、 糖苷酶、 肽键内切酶、 壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。,酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。 在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的

14、变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,2、化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可使细胞破碎。,（1）表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助

15、于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。常用的有甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,（4）变性剂,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的

16、变性剂。,通用性差； 时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%； 有些化学试剂有毒 。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,原理：将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 应用：仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,3、渗透压法（Osmotic pressure）,原理：将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。 应用：适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,4、 反复冻结-融化法,四、破碎率的测定,1、直接测定法 设备：显微镜