课题3　血红蛋白的提取和分离 (2)

1、生物技术实践专题5 DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离，教育目标，重点难点，问题探索，教育课程，知识结构，教育反馈，课后练习，教育参考，1。主要概念：凝胶色频谱电泳法缓冲溶液在血红蛋白提取中分别起到什么作用。主要原理：凝胶色谱分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理，课题重点：凝胶色谱法的原理和方法4，课题难点：样品的预处理色补热填充材料处理和色补热填充。2003年四月十四日，人类基因组序列也宣布完成。这意味着进入了后基因组和蛋白质组时代。人类基因组：DNA分子拥有的所有遗传信息，蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究。2。问：血液的成

2、分是什么？1 .问题：为什么要用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白呢？鸡的红细胞有细胞核，含有DNA，便于提取DNA。人的红细胞没有细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，容易提取血红蛋白。血红蛋白，血红蛋白的特征：分离生物大分子的基本想法：使用物理或化学方法分离具有不同物理或化学特性的生物大分子。2 .蛋白质分离和提取的原理：可以根据分子的形状和大小、电荷的性质和数量、溶解度、吸附特性、对其他分子的亲和力等蛋白质的不同特性，用于分离不同种类的蛋白质。首先，血红蛋白的提取和分离，3 .高温灭菌和酒精灭菌的结果：使微生物的蛋白质变性，破坏蛋白质的空间结构。(a)凝胶色谱(分配色谱)，2。

3、结：大部分凝胶都是由葡聚糖、琼脂糖等多糖组成的多孔球体，内部有很多贯穿通道。根据分离物质的蛋白质相对分子质量大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用进行分离。1 .概念：3。凝胶色谱的原理分子筛效果：当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，长度长，移动速度慢。相对分子量大的蛋白质不能进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，距离短，移动速度快。因此，具有不同相对分子质量的蛋白质分子分离。以蛋白质分子量的大小为基础。4。凝胶色谱法可以抵抗蛋白质的原理和具体过程，外的酸和碱性对溶液PH值的影响，几乎保持PH值不变。2 .作用：3。缓冲溶液的赵霁：通常由12种缓

4、冲剂溶于水而配制。调整缓冲剂的使用比例，可以制作在其他PH范围内使用的缓冲液。，4 .问题：用于牙齿任务的缓冲区金额为： _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _N H4 ohnh 4 cl，nah co 3 na 2co 3NaH2PO4Na2HPO4，缓冲溶液由足够浓度的共轭酸碱对组成。其中能对抗外来强碱的称为共轭酸。能对抗外来强酸的称为共轭碱。牙齿共轭酸碱一般称为缓冲对，缓冲剂或缓冲系。典型的缓冲区对主要为、(3)传记电泳：1。概念：传记粒子在电场作用下移动的过程。2 .原理：许多重要的生物大分子，例如多肽

5、、核酸等，都有可分离的组，在特定的PH中，这些组都有正电或负电。在电场的作用下，牙齿带电分子向与电荷相反的电极移动。传记电泳在要分离的样品中，由于各种分子带电性质的差异和分子本身的大小、形状不同，带电分子徐璐产生不同的迁移速度，因此可以从样品中分离各种分子。3 .类型：琼脂糖凝胶传记电泳，聚丙烯酰胺凝胶传记电泳。，N，N-甲基双丙烯酰胺(交联形成)，丙烯酰胺和交联剂N，N-甲基双丙烯酰胺的交联共聚反应(SDS的作用)您可以在凝胶中加入SDS，以消除净电荷对迁移率的影响。2 .原理：聚丙烯酰胺凝胶传记电泳，SDS能使蛋白质完全变性。由多肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下分解成单肽链，因此测量

6、结果只是单肽链的分子量。SDS可以形成多种蛋白质和蛋白质SDS复合物，SDS远远超过蛋白质分子的原始电荷。因此，不同蛋白质之间的电荷差异被掩盖，传记电泳迁移率完全取决于分子的大小。3 .用SDS官能团：SDS测定蛋白质分子量的方法，用SDS聚丙烯凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可以同时使用已知分子量的标准蛋白质组进行传记电泳。根据已知分子量的标准蛋白质的传记零同带位置，可以用传记游泳迁移率和分子量的对数作为标准曲线来测定未知蛋白质的分子量。市场上出售高剂量、车库量及低分子量的标准蛋白质试剂。2，实验操作，样品处理粗糙分离纯化纯度鉴定1。样品处理：(1)蛋白质提取和分离程序；(2)操作过程；牙齿作

7、业可以选择猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液，将血红蛋白分离出来。(1)红细胞的洗涤：洗涤目的3360，去除杂蛋白，有助于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数太少，渡边杏。清洗工作：1，采集血样。2.低速短时间离心(速度越高，时间越长，白细胞和淋巴细胞等一起沉淀，无法达到分离效果)3。血浆吸收：上层透明的黄色血浆。4.用盐水洗涤：用质量分数为体积5倍的0.9的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心(低速短时间)6、4、5阶段重复3次，表明上清液没有黄色，洗涤干净。、机柜离心机、(3)血红蛋白溶液分离：过程：将混合液转移到离心管，以2000r/min速度离心10 min。试管溶液水平：第一层(顶部):甲苯层(无色

8、透明)；第二层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体)；第三层(中上层):血红蛋白的水溶液层(红色透明液体)；第4层(底部):杂质沉淀层(深红色)。分离：用滤纸过滤，去除脂溶性沉淀层，暂时放置在分液漏斗里，然后分离楼下红色透明液体。(大卫亚设，美国电视电视剧，离别)，2，实验操作，-。2，实验操作，2底部插头制作：钻孔，挖一个凹洞，挖一个移动管头，盖上尼龙网，用100颈尼龙纱包起来，插入玻璃管的一端。注：插入底部插头的玻璃管的顶部不得超过橡胶插头凹孔的底部。否则很难铺尼龙网，可能会发生液体残留物，蛋白质分离无法完成。塔插头制作：钻孔安装玻璃管。组装：根据上述三者的位置将它们组装成一个。安装

9、其他子结构。(2)凝胶色谱柱填充，凝胶选择：a，材料：交联葡聚糖凝胶(G-75)。b，意思：“G”表示凝胶的交叉程度、膨胀程度和分离范围。75表示凝胶的得数值，即每次凝胶膨胀时吸收7.5克。凝胶的字典处理：构成凝胶悬浮液。将一定量的凝胶浸入蒸馏水或洗涤剂中，充分溶解后配制凝胶悬浮液。凝胶频谱柱的填充方法：A，固定：将频谱柱装置固定在支架上。b，充电：一次慢慢地将凝胶悬浮液倒入彩色频谱柱，充电时轻拍彩色频谱柱，使凝胶均匀填充。注：1，凝胶填充时尽量紧密，减少凝胶颗粒之间的间距。2.填充凝胶柱的时候泡沫存在，就会渡边杏存在。因为泡沫扰乱了洗涤剂中蛋白质的溶出顺序，降低了分离效果。组装的凝胶柱，否则

10、，气泡混合，会影响柱内液体流动和最终生物高分子材料的分离效果。2、发生洗脱油类干燥时渡边杏，不能发生凝胶颗粒暴露的现象。(2)凝胶频谱柱的填充，50厘米高，(3)样品添加和洗脱，缓冲面额曹征：打开底部出口，使柱内缓冲液慢慢下降到与凝胶面相同的水平，关闭出口。透析样品：吸管将1ml样品添加到颜色频谱柱的顶部，滴样品时，吸管喷嘴贴在管壁上，移动加形，注意不要损伤凝胶面。样品渗透到凝胶床：添加样品后，打开底部出口，使样品渗透到凝胶床，样品完全进入凝胶层后，关闭底部出口。溶出：小心地将pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液放在适当的高度，连接缓冲液溶出瓶，打开底部出口洗涤。收集：红色蛋白质接近颜色

11、频谱柱底部时，用试管收集流出液，每5毫升收集试管继续收集。(在分离过程中，如果红色条带均匀移动，则表明已成功创建颜色频谱柱。)1，不要触摸，破坏凝胶面。2、贴纸加样品。3、让吸管喷嘴沿管壁移动。(3)添加和洗脱样品，注意：正确的追加操作如下：1，不要触摸凝胶面，销毁。2、贴纸加样品。3、让吸管喷嘴沿管壁移动。，3，2，红细胞与其他真核细胞相比有什么特点？牙齿特征对你分离蛋白质有什么意义？血红蛋白是有色蛋白，当凝胶色谱分离时，通过观察颜色，可以决定何时收集洗涤剂。这使得血红蛋白的分离过程非常直观，实验操作大大简化。3，能否说明血红蛋白分离的完整过程？血红蛋白提取和分离程序可分为试样处理、粗分离、

12、纯化、纯度鉴定等四个阶段。首先，通过红细胞、血红蛋白释放、离心等操作，提取血红蛋白溶液，即：样品。经过透析，去除分子量小的杂质，即样品的粗分离。然后通过凝胶色谱法去除相对分子质量大的杂质蛋白，即：样品的纯化。最后，用聚丙烯酰胺凝胶传记电泳进行了纯度鉴定。(3) SDS聚丙烯凝胶传记电泳，2 .试剂的制备：确认血红蛋白的纯度。1 .目的：以脱离子水制备丙烯酰胺和N，N-甲基双丙烯酰胺：以29%(29 g/100 mL，河东)的丙烯酰胺和1% N，N-甲基双丙烯酰胺的贮存。12烷基硫酸钠(SDS):用去离子水配制10%的储液，在室温下保存。树缓冲液，用于制造分离胶和浓缩胶。TEMED:催化过硫酸铵

13、形成自由基，加快丙烯酰胺和二丙烯酰胺的聚合。用去离子水配制10%过硫酸铵。具有驱动丙烯和双丙烯酰胺聚合所需的自由基础的作用。牙齿溶液必须配制新鲜液体。Tris甘氨酸传记电泳缓冲液：25 mmol/L Tris，250 mmol/L甘氨酸(pH 8.3)，0.1% SDS。样品处理液：50 mmol/L TrisHCl(pH 6.8)、100 mmol/L巯基乙醇(MMMOL/L DTT)或5%巯基乙醇、2% SDS、0.1%溴酚蓝脱色液：10%的甲醇和10%的冰醋酸。1、准备凝胶的丙烯酰胺和二丙烯酰胺具有很强的神经毒性，容易被皮肤吸收，因此必须在通风场内或通风场工作。2.TEMED和过硫酸胺对粘膜和上部呼吸机组织、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞咽的话会致命。3.做传记游泳工作时，必须按照实验要求和程序完成。工作的时候请戴一次性手套。注意事项：(3) SDS聚丙烯凝胶电游泳，SDS-聚丙烯酰胺分离剂：去离子水4.6 mL，30%丙烯酰胺2.7 mL，1.5mol，pH 8.8的三缓冲液2.5 mL两块玻璃板之间的空隙分离胶完全聚合后(约30毫米)，倾斜盖子层，用滤纸把残留物吸干。SDS聚丙烯凝胶传记游泳富集溶液为去