中科院生物物理所生物化学与分子生物学真题及部分答案.pdf

1、生化与分子生物学生化与分子生物学 2011 简答（10 分*6） 1.生物膜的基本成分。每种成分又分为哪几类？生物膜的基本成分。每种成分又分为哪几类？ 答：生物膜主要有脂质、蛋白质和糖类三部分构成。是由脂质组成磷脂双分子层，膜蛋 白镶嵌在膜的表面或者膜中。组成生物膜的脂质主要由甘油磷脂、鞘磷脂、固醇和少量 的糖脂，其中以磷脂为主要成分，分布很广泛；组成生物膜的蛋白质种类很多，根据膜 蛋白分离的难易程度和与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为：外在膜蛋白、内在膜蛋白 和脂锚定膜蛋白三种。其中外在膜蛋白为水溶性蛋白质，靠离子键或其他较弱的键与膜 表面的膜表面的膜蛋白分子或者膜脂分子结合。内在膜蛋白与膜结

2、合紧密，只有用去垢 剂处理使之崩解后才能分离。脂锚定膜蛋白是通过与之共价结合的脂分子插入膜的脂双 层中，而锚定在细胞质膜上。组成生物膜的糖类主要有半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡 萄糖胺、葡萄糖和唾液酸等，大都以与膜蛋白少量与膜脂结合的形式存在。 2.信号肽的含义，作用，怎么起作用的？（生化下册信号肽的含义，作用，怎么起作用的？（生化下册 P533） 答：信号肽是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短（长度 5-30 个氨基酸）肽链。 在起始密码子后， 有一段编码疏水性氨基酸序列的 RNA 区域， 该氨基酸序列就被称为信 号肽序列，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内，指导蛋白质的跨膜

3、 转移（定位） 。 编码分泌蛋白的 mRNA 在翻译时首先合成的是 N 末端带有疏水氨基酸残基的信号 肽，它被内质网膜上的受体（信号识别蛋白（signalrecognitionparticle,SRP） ）识别并与之 相结合。信号肽经由膜中蛋白质形成的孔道到达内质网内腔，随即被位于腔表面的信号 肽酶水解，由于它的引导，新生的多肽就能够通过内质网膜进入腔内，最终被分泌到胞 外。翻译结束后，核糖体亚基解聚、孔道消失，内质网膜又恢复原先的脂双层结构。 3.体外蛋白质相互作用的方法，列举三种，简述原理体外蛋白质相互作用的方法，列举三种，简述原理。 （略（略见细胞生物学）见细胞生物学） 4.现代结构生物

4、学中三种最重要的研究方法，各有什么优缺点。现代结构生物学中三种最重要的研究方法，各有什么优缺点。 答：电镜三维重构技术与 X 射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前再结 构生物学领域用于研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。 X 射线射线是波长在 1000.01之间的一种电磁辐射, 常用 X 射线波长约在 2.50.5之 间，与原子以及化学键的尺度相当，都在 的数量级。因此可以被用来探测蛋白质分子 内部的结构。X 晶体衍射优点晶体衍射优点：分辨率高,达到原子分辨率,既可研究水溶性蛋白、也可研 究膜蛋白和大分子组装体与复合体. 它能给出生物大分子的分子结构和构型,确定活性

5、中心的位置和结构,从分子水平理解蛋白质如何识别和结合客体分子,如何催化,如何折叠 和进化等生命的基本过程,进而阐明生命现象. 然而 X 射线单晶衍射方法也有缺点缺点,就是 样品必须为晶体，但生物大分子结晶困难，特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更是 困难。其次对于像病毒那样大的分子组装体，测量其精细结构十分复杂. 原因有二：一 是大晶胞含有的原子极多，X 射线衍射点极多，常常无法区分、辨认和探测；二是大晶 胞所产生的衍射点强度过弱，特别在高分辨时，无法与背景区分。 电镜三维重构：优点：电镜三维重构：优点：适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质-核酸 复合物等大的复合体的三维结构。

6、急速冷冻(103 -104 Ps) 样品悬液,样品被包埋在无定 形的非晶态冰薄膜中,这样既不损伤样品,又可使样品保持着自然状态,因而样品制备简单, 缺点缺点是分辨率稍低. 核磁共振分析技术：最大的优点是可以直接在溶液中测定自然状态下的大分子三维空间 结构,其分辨率已接近 012nm 。缺点：因为大分子量的生物分子的核磁共振图谱非常复 杂,难以解释,因此它只能测量分子量较小(15-25kDa)的生物分子,至今最大可测定 35kDa 的生物分子; 其次在测定中要求样品是高纯度且数量相对较多,使样品制备亦有困难;此 外,核磁共振只能用于水溶液性的生物样品,对膜蛋白或病毒等的组装体、复合体就无法 测定

7、。 5.一个嗜热菌中的一个蛋白的最适温度为一个嗜热菌中的一个蛋白的最适温度为 65 度，等电点度，等电点 5，PH 小于小于 5 时易沉淀，分子量时易沉淀，分子量 为为 30KD，由由 Histag，已在大肠杆菌里过表达已在大肠杆菌里过表达，设计实验得到纯度高且单分散的蛋白质设计实验得到纯度高且单分散的蛋白质。 6.染色质的基本成分是什么，核小体怎么装配成染色体的。染色质的基本成分是什么，核小体怎么装配成染色体的。 答：基本成分：核小体是染色质的基本单位，是真核细胞染色体中 DNA 最简单的包装结 构，核小体由大约 200 个碱基对组成的 DNA 序列和由两个拷贝 H2A,H2B,H3 和 H

8、4 组成 的蛋白八聚体和一个拷贝的组蛋白 H1 组成。DNA 在细胞核内与蛋白质一起形成高度组 织化的核蛋白复合体， 称为染色质。 染色质的包装并非一步到位， 而是由几个阶段组成： 第一阶段：DNA 缠绕一个蛋白核心形成念珠状结构称为核小体，长度压缩 6 倍。 第二阶段：核小体进一步缠绕成直径 30nm 左手螺旋纤维结构，每圈由 6 个核小体组成 压缩了 40 倍。 第三阶段：30nm 纤维进一步缠绕成环，支架和结构域等结构压缩 1000 倍，形成染色体 压缩 1 万倍。 论述题：论述题： 1. 整套分子克隆实验整套分子克隆实验(略略) 2. 给出一个给出一个 3 肽，标出其中的肽键，肽平面，

9、二面角。肽，标出其中的肽键，肽平面，二面角。螺旋和螺旋和折叠的结构特点，给出折叠的结构特点，给出 一个拉式构象图，标出一个拉式构象图，标出螺旋和螺旋和折叠的分布位置。折叠的分布位置。GH 黄色框内为肽平面，两个太平面绕 C旋转形成二面角，绕 C-N 键（左）旋转形成的二 面角（C-N-C-C）称为。绕 C-C 键（右）旋转形成的二面角（N-C-C-N）称为。 （ ： fai Phi ：普赛 Psi ） 螺旋：是蛋白质中最常见最典型含量最丰富的二级结构元件，有一下特点： 1.螺旋是一种重复性的结构，螺旋中每个-C 的和分别为-57和 -47附近。 2.多肽链主链围绕统一中心轴螺旋式上升，形成螺旋

10、结构。3.6 个氨基酸 残基旋转一周，上升垂直距离 0.54nm。因此每个氨基酸残基围绕螺旋中心轴旋 转 100，上升 0.15nm。 3.相邻的螺旋之间形成链内氢键。 即从 N-末端出发， 氢键是由每个肽键中 的羰基原子与其前面第 3 个肽键的 N-H 之间形成的。 4.R 基侧链位于螺旋的外侧，以减少空间位阻效应，但螺旋的形成和 稳定性仍受 R 基侧链的影响。 5.螺旋分为左手螺旋和右手螺旋。天然蛋白质分子中的螺旋绝大 多数都是右手螺旋。 折叠： 是蛋白质多肽链主链的另一种有规则的构象形式。 由两条或多条几乎完全伸展的多 肽链，借助链间形成的氢键，侧向聚集在一起而形成的折叠的层状结构。其特

11、征如 下： 1. -折叠的一条肽链或肽段中构成肽键的羰基氧原子与另一条肽链或肽段中构成 肽键的-NH 的氢原子生成氢键，-折叠中所有的肽键都参与了链间氢键的形成。 2. -折叠的多肽链主链是比较伸展的，呈锯齿状折叠构象；侧链 R 基交替地分布在 片层平面的上方和下方，以避免相邻侧链 R 基之间的空间障碍。 3.-折叠机构有平行式和反平行式两种。 生化与分子生物学生化与分子生物学 2012 1. 四种蛋白质相互作用的方法及原理四种蛋白质相互作用的方法及原理 答： 蛋白质相互作用按其特征基本上可分为稳定和瞬时相互作用。 稳定相互作用是指蛋白质 相结合可以作为多亚基复合体的形式被纯化。稳定相互作用可

12、以用免疫共沉淀（co-ip、 pull-down 或 far-western 方法来进行研究分析）瞬时相互作用是参与对大多数细胞过程的 调控。本质上是参与开/关或暂时的相互作用。瞬时相互作用可被交联或标记转移等方法所 捕获。下面介绍常用的研究蛋白相互作用的方法：（1）. 酵母双杂交系统：双杂交系统的 建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因 子的参与。 这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成, 其中有 DNA 结合结构域 （DNA binding domain，简称为 BD）和转录激活结构域（activation domain，简称为 AD）

13、， 它们是转录激活因子发挥功能所必需的。 在双杂交试验中组建两个融合蛋白： 一个 DNA 结合 结构域融合到目标蛋白 X 的 N 末端，X 蛋白质的潜在结合蛋白（Y）被融合到激活结构域。 如果蛋白质 X 和蛋白质 Y 相互作用， 这两个蛋白质的结合将形成一个完整的、 具功能的转录 激活蛋白因子。 这个新形成的转录激活蛋白因子将起始一个报告基因的转录， 报告基因的翻 译产物能很容易地被检测。 （2）.利用绿色荧光蛋白（GFP）片段重组装研究蛋白质相互作用细菌双杂交。与酵 母双杂交的原理相似。通过将所要研究的蛋白质分别与 DNA 结合域（DBD）与活化域（AD） 融合，利用相互作用蛋白质提供的桥联

14、功能，使活化域与 DNA 结合域结合，从而调控报告基 因的表达。报告基因表达的调控结果可通过生化或遗传学的方法检测到。 （3）. 免疫共沉淀（co-ip）。原理是一个抗特异性的靶抗原的抗体同在样品中的靶抗 原形成免疫复合体。是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的 ProteinA 或 G 特异性地 结合到免疫球蛋白的 Fc 片段的现象开发出来的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加抗兴 趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于 Agarose 珠上的 ProteinA 或 G， 若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物： “目的蛋白兴趣蛋 白抗兴趣蛋白抗体Protein

15、A 或 G”，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。 然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。 这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然 结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是 否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的 相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相 互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作 用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；

16、（3） 必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就 得不到结果，方法本身具有冒险性。 （4）交联质谱技术：交联质谱技术是今年发展起来的新方法，它是利用化学交联剂 处 理蛋白样品，将空间距离足够接近、可以与交联剂反应的两个氨基酸以共价键连接起来，产 生共价交联来捕获蛋白质-蛋白质复合体的一种方法，然后利用基于质谱技术的蛋白质组学 手段分析交联产物。 （5）Far-Weatern 分析: Far-Weatern 与 Western Blot 十分类似，只不过 Far-Weatern 中， 是用的一个标记的或可用抗体检测的诱饵蛋白检测转移到膜上的猎物蛋白质。 所

17、用的诱 饵蛋白是纯化过的蛋白。 依照诱饵蛋白上是否存在标记或者标签， 可选择下列四种方法之一 用于 Far-Weatern 蛋白-蛋白相互作用的检测。（放射标记的猎物蛋白、用猎物蛋白抗体检 测、溶融合蛋白中标签的抗体检测、用生物素标记的猎物蛋白检测） （6）标记转移法：1 被标记的转移试剂首先与 Bait（诱饵）蛋白反应后将其标记，2 将这个标记的诱饵蛋白加到待检测样品中， 在适当条件下与其他蛋白质相互作用，3 实验 样品在紫外光下产成交联，生成相互作用复合体，4 通过还原转移试剂中的-S-S-键，将标 记物（L）转移至与 Bait 蛋白相互作用的蛋白质上，5 最后，用标记 L 纯化或者检测相

18、互作 用的蛋白质。 这种方法可以检测弱相互作用和瞬时相互作用，因此被广泛使用。其中转移 试剂可以是 125I 也可以用生物素或其他的荧光（荧光共振能量转移）或生色基团标记。 （7）噬茵体展示技术：在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的 DNA 序列， 当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与 相应抗体特异性结合， 这被称为噬菌体展示技术。 此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互 作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在 筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。 （8）Pull-down：用

19、于体外检测两个或多个蛋白质之间物理相互作用的方法，即可确认 被其他方法所预测的蛋白质相互作用的存在， 又可检测未知蛋白质的相互作用。 这一方法仅 需一个纯化的、 含有标签的或被标记的诱饵蛋白质， 通过标签将其与固相介质上的标签特异 性亲和配体结合，将诱饵蛋白固定到固相介质上，形成 Bait-亲和介质。这样可通过亲和层 析法从细胞裂解液或其他蛋白混合物中结合、纯化与 Bait 蛋白相互作用的 Prey 蛋白。 （9）蛋白质芯片：将各种蛋白质（抗体、蛋白质、态等）有序的固定在固相载体（玻 片，尼龙膜）上，成为检测用的芯片。然后用此芯片去筛选、检测实验样品中与芯片上蛋白 质相互作用的蛋白质。 （10

20、）表面等离子共振技术：表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已 成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋 白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，信号的改变与结合的程 度成正比。通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR 技术的优点是不需标记物或染料， 反应过程可实时监控。 测定快速且安全， 还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的 相互作用。 （11）质谱分析、核磁共振、X 射线晶体学分析等技术也可用于蛋白互作的研究，但是 成本昂贵。 2. RNA 编辑及其生物学意义编辑及其生物学意义 R

21、NA 编辑是指在 mRNA 水平上改变遗传信息的过程。具体说来，指基因转录产生 mRNA 分 子后，由于核苷酸的位点特异性脱氨基作用，尿嘧啶的插入或删除，从而使 RNA 在转录后 改变核苷酸的序列， 使翻译生成的蛋白质的氨基酸组成， 不同于基因序列中的编码信息现象。 生物学意义生物学意义： 1. 通过编辑校正基因的移码突变，使应对有害突变的一种方式。 2通过 RNA 编辑可以在基因原来的起始密码子前构建新的 AUG 起始密码扩展了原基因 所编码的 mRNA 的翻译序列， 使扩充遗传信息的一种手段。3 是对中心法则的一个非常重要的补充， 使得从基因序列推测蛋白质序列的更加负责， 也使得 基因表达

22、调控变得更加复杂。 3.蛋白纯化方法和原理蛋白纯化方法和原理 （见（见 13 年）年） 4.表观遗传学及其生物学意义表观遗传学及其生物学意义 答： 表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下， 基因表达了可遗传的变化的 一门遗传学分支学科。表观遗传学内容包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、遗传 印记、随机染色体失活及非编码 RNA 等调节。总之，从表观遗传现象的认识到对表观遗传 学的深入研究， 表观遗传学将对重大医学问题的阐明作出贡献， 尤其表观遗传学与干细胞的 分化与组织再生、衰老、DNA 的损伤与修复、肿瘤发生的关系，表观遗传信号的建立、维 持、传递，表观遗传信号与细胞信

23、号的互相影响，表观遗传与生长发育与生活环境的关系等 将会进而取得突破，这些也会为眼科的研究带来巨大的影响与带动。 5.双链双链 DNA 断裂的修复方式断裂的修复方式 答： 6.蛋白质的共价修饰及功能蛋白质的共价修饰及功能 答：多肽链在核糖体上合成的过程中或合成后，一般都要经过修饰加工。多肽链的修饰加工 对于其生物活性的表达至关重要。 目前以发现至少有 350 多种共价修饰。 其中常见的修饰方 法有： 1. 蛋白水解切割:如处于多肽 N 端起始甲硫氨酸的去除和胰岛素形成过程中前肽序列 的切除 2.对多肽链中特定氨基酸侧链基团的修饰。如酰化，甲基化，磷酸化，异戊烯化，硝 基化，亚硝基化，泛素化等等

24、。 3糖基化：蛋白质的糖基化是对蛋白质最重要的修饰方式，所产生的糖蛋白由蛋白 质及与其相连的碳水化合物组成。 功能：蛋白质翻译后修饰对蛋白质加工成熟、变构和多样化的功能有重要作用，研究蛋白质 翻译后修饰， 将有助于认识翻译后修饰在机体生命中的意义和在分子水平上揭示复杂的蛋白 质功能，以及有助于控制蛋白质翻译后修饰过程并对其进行调节。 7.重组蛋白表达系统及其优缺点重组蛋白表达系统及其优缺点 答 ：重组蛋白表达系统主要由原核表达和真核表达系统：优缺点见 2013 年第三题 8.实验题，转录因子与启动子结合区域的判定实验题，转录因子与启动子结合区域的判定（略 第四章 RNA 转录和转录后加工） 生

25、化与分子生物学生化与分子生物学 2013 1.酸性、碱性、极性、非极性、疏水、必须氨基酸都有哪些？酸性、碱性、极性、非极性、疏水、必须氨基酸都有哪些？ 1酸性氨基酸（有两个羧基）：古天乐古(谷氨酸)天（天冬氨酸）乐，酸酸的。 2碱性氨基酸：精简癞子的阻挠精（精氨酸）简（碱性）癞子（赖氨酸）的阻挠 （组氨酸） 3必需氨基酸：一家人来写三两本书一（异亮氨酸）家（甲硫氨酸）人来（赖 氨酸）写（缬氨酸）三（丝氨酸）两（亮氨 酸）本（苯丙氨酸）书（苏氨酸） 4极性氨基酸：老姑苏慕容复天天吃鸡蛋丝拌饭酪氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、天 冬氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、半胱氨酸 5非极性氨基酸（疏水） ：加一两个饼干补血

26、色甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、丙 氨酸、甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸。 2.染色体基本单位及组装过程染色体基本单位及组装过程。 （2011 年第六题）年第六题） 3.真核原核蛋白表达系统优缺点。真核原核蛋白表达系统优缺点。 答：真核表达系统-优点：具有对重组蛋白进行所有类型的翻译后修饰的能力，所表达的 重组蛋白以与天然宿主中相同的形式存在。 缺点： 培养液中细胞密度低， 生长缓慢， 成本高， 基因操作困难。其次哺乳动物中含有癌基因和病毒 DNA，对重组蛋白产物的测试繁杂费时。 原核表达系统-优点：培养条件简单、基因操作容易、从构建到产物纯化周期短、成本 低、产量高、易于规模化。缺点：不能对表

27、达的蛋白质进行翻译后修饰，这对于糖基化抗原 的表达是非常大的缺陷。 使用原核表达系统表达的蛋白质不能有效地折叠产生复杂的高级结 构，限制了其使用。原核表达系统的另一个缺陷是，生产的目的蛋白中会残留一定量的菌体 蛋白，用作检测时可以产生很强的背景干扰。 4.GPCR 结构和功能特点。结构和功能特点。 结构：G 蛋白偶联受体（G Protein-Coupled Receptors，GPCRs）是一肽类膜蛋白受体的统称。 均是膜内在蛋白 （Integral membrane protein） ， 每个受体内包含七个螺旋组成的跨膜结构域， 这些结构域将受体分割为膜外 N 端 （N-terminus）

28、， 膜内 C 端 （C-terminus） ， 3 个膜外环 （Loop） 和 3 个膜内环。 受体的膜外部分经常带有糖基化修饰。 膜外环上包含有两个高度保守的半胱 氨酸残基，它们可以通过形成二硫键稳定受体的空间结构。有些光敏感通道蛋白 （Channelrhodopsin）和 G 蛋白耦联受体有着相似的结构，也包含有七个跨膜螺旋，但同时 也包含有一个跨膜的通道可供离子通过。与 G 蛋白偶联受体相关的疾病为数众多，并且大 约 40%的现代药物都以 G 蛋白偶联受体作为靶点。由 G 蛋白偶联受体所介导的细胞信号通 路按其效应器蛋白的不同。可分为 3 类：一是激活离子通道的 G 蛋白偶联受体。二是激

29、活 或抑制腺苷酸环化酶，以 cAMP 为第二信使的 G 蛋白偶联受体。三是激活磷脂酶 C，以 IP3 和 DAG 为双信使的 G 蛋白偶联受体。 功能：1 感光：视紫红质是一大类可以感光的 G 蛋白偶联受体。 2 嗅觉：鼻腔内的嗅上皮（Olfactory epithelium）和犁鼻器上分布有很多嗅觉受体，可以感 知气味分子和费洛蒙。 3 行为和情绪的调节：哺乳动物的脑内有很多掌控行为和情绪的神经递质对应的受体是 G 蛋白偶联受体，包括血清素，多巴胺，-氨基丁酸和谷氨酸等。 4 免疫系统的调节：很多趋化因子通过 G 蛋白偶联受体发挥作用，这些受体被统称为趋化 因子受体。其它属于此类的 G 蛋白

30、偶联受体包括白介素受体（Interleukin receptor）和参与 炎症与过敏反应的组胺受体（Histamine receptor）等。 5 自主神经系统的调节：在脊椎动物中，交感神经和副交感神经的活动都受到 G 蛋白偶联 受体信号通路的调节，它们控制着很多自律的生理功能，包括血压，心跳，消化等。 6 细胞密度的调节：最近在盘基网柄菌中发现了一种含有脂质激酶活性的 G 蛋白偶联受体， 可以调控该种黏菌对细胞密度的感应。 7 维持稳态：例如机体内水平衡的调节。 5.蛋白纯化方法。蛋白纯化方法。 答：分离纯化某一特定蛋白质的一般程序可以分为前处理、粗分级分离和细分级分离三步。 （1）前处理：

31、分离纯化某一蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或者细胞中以 溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失生物活性。根据不同的 情况选择合适的方法将组织和细胞破碎。动物组织和细胞用匀浆机或者超声波 处理，植物细胞用石英和提取液一起研磨或者用纤维素酶处理，细菌细胞用超 声波震荡破碎。破碎后选择合适的缓冲液将所要的蛋白质提取出来。如果所要 的蛋白质集中在某一细胞组分，如细胞核，染色体，核糖体或可溶性的细胞质 中，则可利用差速离心的方法将他们分开。如果所要的蛋白质是与细胞膜或膜 质细胞器结合的，则必须用超声波或者去污剂使膜结构聚集，然后用适当的介 质提取。 （2）粗分级分离：当蛋白质提取液获得后

32、，选用一套合适的方法，将所要的蛋白质 与其他杂蛋白分离开来。一般这一步的分级分离采用盐析、等电点沉淀和有机 溶剂分离等方法。如果蛋白提取液体积大，又不适合用沉淀或盐析法浓缩，则 可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。 （3）细分级分离：也就是样品的进一步纯化。样品经过粗分级分离处理后。一般体 积较小，杂蛋白大部分已被除去。进一步纯化一般使用层析法（凝胶过滤、离 子交换层析、吸附层析以及亲和层析等） 。必要时还可以选择电泳法，包括区带 电泳、等点聚焦等作为最后的纯化步骤。用于细分级分离的方法一般规模较小， 但分辨率很高。 （4）结晶是蛋白质分离纯化的最后步骤。尽管结晶不能保证蛋

33、白质一定是均一的， 但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。结晶时判定制品处 于天然状态的有力指标。蛋白纯度越高，溶液越浓就越容易结晶。结晶的最佳 条件是使溶液略处于过饱和状态，此时较易得到结晶。要得到适度的过饱和溶 液，可借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节 PH 等方法达到。 介绍几种依据蛋白质在溶液中的下列性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小、溶解度、电介绍几种依据蛋白质在溶液中的下列性质分离纯化蛋白质的方法：分子大小、溶解度、电 荷、吸附性质和对配体分子的生物学亲和力等荷、吸附性质和对配体分子的生物学亲和力等 （一）（一）根据分子大小不同的纯化方法根据分子大小不同的纯化方法

34、 1.透析和超过滤：透析是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白 质和其他小分子物质。超过滤是利用压力或者离心力，强行使水和其他小分子 溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上。 2.密度梯度（区带）离心：蛋白质颗粒的沉降不仅决定与它的大小，而且 决定与它的密度。蛋白质溶液在具有密度梯度介质中（蔗糖密度梯度）离心时， 每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时即停滞不前，最后各 种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 3.凝胶过滤：即凝胶过滤层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最 有效的方法之一。当不同分子大小的蛋白质流经凝胶层析柱时，比凝胶珠孔径 大的分子不能进入珠内网状结构，而

35、被排阻在凝胶珠之外最先流出，比网孔小 的分子能不同程度的自由出入凝胶珠的内外，这样由于不同大小分子所经的路 径不同而得到分离，大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后洗脱出来。然后 收集不同峰值的蛋白质坚定。 （二）（二）利用溶解度差别的纯化方法利用溶解度差别的纯化方法。 （PH、离子强度、介电常数、温度）、离子强度、介电常数、温度） 1.等电点沉淀和 PH 控制：蛋白质处于等电点时，其静电荷为零，由于相 邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。 2.蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响，低 浓度的中性盐可以增加蛋白的溶解度，称为盐溶。当溶液的离子强度增加到一 定数值时，

36、蛋白质溶解度开始下降，当离子强度增加到足够高时，很多蛋白质 从水溶液中析出，称为盐析。 3.有机溶剂分级分离：与水互溶的有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮）改变了 介质的介电常数，能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 4.温度对蛋白质溶解度的影响：一般情况下，在一定温度范围内 0-40之 间大部分蛋白质溶解度随温度的升高而增大。 （三）（三）根据电荷不同的纯化方法（电泳和离子交换层析）根据电荷不同的纯化方法（电泳和离子交换层析） 电泳:在外电场作用下，带点颗粒将向着与其电性相反的电极移动，这种现象 称为电泳。 （双向电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、等电聚焦、层析 聚焦、离子交换层析） （四）利用选

37、择性吸附的纯化方法利用选择性吸附的纯化方法： 利用纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间 的吸附能力和解吸性质不同而达到分离的目的。如羟磷灰石层析和疏水作用 层析（苯基琼脂糖和辛基琼脂糖） 。 （五）利用配对体的特异生物学亲和力的纯化方法利用配对体的特异生物学亲和力的纯化方法： 利用蛋白质分子与其配体 分子特有的识别能力建立起来的一种有效的纯化方法，只需一步处理即可将 某种所需蛋白质从复杂的混合物中分离出来，且纯度很高。 （六）（六）高效液相层析和快速蛋白液相层析高效液相层析和快速蛋白液相层析 6.蛋白互作四种方法蛋白互作四种方法 7.整套分子克隆实验。整套分子克隆实验。 8.凝胶阻滞实验，考察了蛋

38、白二聚体等凝胶阻滞实验，考察了蛋白二聚体等 答：凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMSA， electrophoretic mobility shift assay） ，是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的 验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA 互作研究。 一、实验原理 EMSA 主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。 根据实验设计特异性 和非特异性探针， 当核酸探针与样本蛋白混合孵育时， 样本中可以与核酸探针结合的蛋白质 与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁 移较慢，

39、而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后， 蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。 二、实验操作步骤 1、实验前准备 （1）合理的实验方案 根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组， 如有必要还可以添加特 异性抗体组、特异性核酸竞争组等。 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实 验中等量加入蛋白。 （3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记， 可以合成核酸后自行添加， 部分已知蛋白有商业 化的抗体也可以直接购买。 现在大多数实验室已经不再使用放

40、射性标记， 生物素使用相对较 多。 2、形成蛋白-探针复合物 （1）在 0.5ml 离心管中按顺序将下列组份混匀： （2）冰浴 5min 后，加入 1探针。 （对照组加 1ul 对照探针） （3）PCR 仪中室温（20-23）温育 30min。 3、制备凝胶，电泳 （1）制备 6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶： （注意根据试剂情况按比例调整总体积） 5XTBE1ml 30%Acrylamide/Bis2.2ml deionized,sterilewater6.62ml 80%Glycerol80l 10%AP90l TEMED10l 总体积10ml （2）按标准步骤制备凝胶。 （3）加样前先在预冷

41、的 0.5X TBE buffer 中 120V 预电泳 10min，与电泳完毕后冲洗加样孔。 （4）混合样本及电泳缓冲液，点样电泳。 蛋白样本（2-5g）Xl poly d(I-C)1l Binding Buffer2l Nuclease-Free ddH2OXl 总体积9l （5）将电泳槽置于冰上或者 4环境中，恒压 100V 进行电泳，直至缓冲液指示带距离凝胶 底部 23cm 为止。 （大约 50-60min， 根据实际情况调整电泳时间及电压； 电泳时间不宜过长） 4、转膜 （1）在预冷的 0.5XTBE 中浸泡凝胶，膜，滤纸和纤维垫。 （2）按如下顺序组装“三明治” ：纤维垫，滤纸，凝

42、胶，膜，滤纸，纤维垫。注意电极，确 保凝胶位于阴极、膜位于阳极。 （3） 在预冷的 0.5XTBE 中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中， 恒压 60V 转膜 1h。 （注意根据实际情况调整电压及时间） 。 5、检测 （1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗。 （注意整个检测过程避免膜干 燥） （2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭 20min。 （3）加入适量的 HRP 酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate） ，室温震荡孵育 45min。 （勿将酶标记物直接加到膜上） （4）去掉酶联物稀释液，用洗涤缓冲液洗膜三次，每次室温

43、轻微震荡 1 0min。 （5）配置反应底物，均匀加至膜上，室温孵育 5min。 （可以在加完底物后，用薄膜轻轻覆 盖在膜上，是底物均匀覆盖，注意不要产生气泡） （6） 化学发光成像系统曝光成像 （曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整） 。 四、四、Super-Shift EMSA 非纯化的蛋白样本和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。确定复合物 中蛋白的特征可能会困难，可以加入目的蛋白的抗体，进行超迁移实验，即 Super-Shift EMSA。抗体和蛋白/探针复合物中的蛋白结合，使复合物的迁移延迟，形成超迁移。 Super-Shift EMSA 工作原理；在反应体系

44、中，抗体与 DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应 形成复合物会引起复合物的体积变大，在非变性凝胶中的移动变慢而与 DNA/蛋白复合 物区别开。 进行进行 Super-Shift EMSA 需要考虑以下因素：需要考虑以下因素： 1）一般先做一般的 EMSA 测定，成功后才考虑做 Super-Shift EMSA 实验。 2）不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的表面抗原决定簇 起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。 3）抗体的浓度要高。一般 10-20ul 的反应液需要使用 0.5-1ul 原倍的抗体。 3）为减少非特异性反应，尽量使用纯

45、化的抗体。 4）单抗与多抗都可用于 Super-Shift EMSA，但多抗可能与 DNA/蛋白复合物形成大的聚 集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到 Super-Shift 的带，但应当可以看到 DAN/蛋 白复合物的电泳带明显减少。 五、常见问题 1、为什么看不到迁移带？、为什么看不到迁移带？ 1）蛋白样本提取质量不高，蛋白降解或者提取量不足。 2）样本中没有可以与探针结合的蛋白。 3）探针与蛋白无特异性的相互作用。 4）转膜效率低，蛋白或者探针未转移到膜上。 5）曝光或者成像时间过短。 在 Super-Shift EMSA 测定中看不到 Super-Shift DNA/蛋白复合物带还可

46、能有以下原因： 6）抗体没有工作。不是所有的抗体都可以用于 Super-Shift EMSA，只有对非变性蛋白的 表面抗原决定簇起反应的抗体才能够用于 Super-Shift EMSA。 7）测定的活化的 DNA/蛋白复合物中没有希望检测的构成成分存在。此时既看不到 Super-Shift 的带，也看不到 DNA/蛋白复合物的量的减少。 8）使用的抗体过度稀释。一般 10-20ul 的反应液需要使用 0.5-1ul 原倍的抗体。 9）多抗与 DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下，虽然看不到 Super-Shift 的带，但应当可以看到 DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。 2

47、、为什么实验背景高？、为什么实验背景高？ 1）曝光或者成像时间过长。 2）封闭时间不足或者效率不高。 3）洗涤效果不佳 4）实验过程中膜没有一直处于湿润状态。 3、EMSA 测定需要多少量的蛋白与标记的探针？测定需要多少量的蛋白与标记的探针？ 对每一个特定的结合蛋白和探针，所用的纯化蛋白，部分纯化蛋白，粗制核抽提液需作 优化：一般所用纯化蛋白的量在 20-2000ng 间，可将蛋白:DNA 的等摩尔比调整为蛋白的 摩尔数是 DNA 的 5 倍；用粗制核抽提液，需要 2-10ug 蛋白形成特异的复合物。 部分纯化蛋白与粗制核抽提液应保存在-80、探针应保存在-20以防止降解。 无论探针或是结合蛋

48、白都应避免多次冻融。 4、Poly(dI:dC)，非特异性竞争，非特异性竞争 DNA，特异性竞争，特异性竞争 DNA 在在 EMSA 测定中的作用？测定中的作用？ Poly(dI:dC)由肌苷和胞嘧啶组成。在 EMSA 反应中加入 poly(dI:dC)，可抑制粗制核抽提液 中转录调节因子与标记探针的非特异结合。结合溶液中的 poly(dI:dC)的用量需在正式实 验前进行优化，一般用量大约在 0.05mg/ml 左右。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时， 不必一定加入 poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过 50-100ng。对核抽 提液，每 2-3ug 核抽提液用 1 u

49、g poly(dI:dC)。 为确定所形成的复合物的特异性， 在含或不含增量的特异竞争 DNA 或非特异的竞争 DNA 时，作结合反应的竞争实验。一般，特异竞争探针是非标记的 DNA，其序列与标记探针 相同， 故能与标记探针竞争与结合蛋白的反应。 非特异竞争探针的长度组成和 DNA 探针 相同，但序列不同。如果结合蛋白与标记探针的结合被特异竞争探针抑制，而不受非特 异探针的影响表明靶结合蛋白的存在。特异与非特异性竞争 DNA 的用量也需优化或滴 定，但竞争 DNA 通常是标记的探针用量的 30-100 倍（w/w） 。 5、用什么凝胶条件将蛋白质、用什么凝胶条件将蛋白质/探针复合物和游离的探针

50、分离开？探针复合物和游离的探针分离开？ 将结合蛋白或粗制核抽提液和目的探针结合，蛋白/探针复合物和游离探针可在非变性 聚丙烯酰胺凝胶中经电泳分离。聚丙烯酰胺的浓度一般为 6%，在特定条件下可用高或 低的浓度。也可将 TGE 缓冲液（12.5mM Tris，pH8.3，95mM 甘氨酸，0.5mM EDTA）用 于不稳定的蛋白/DNA 复合物。 在 4进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的 解离。 当带型不紧密出现拖尾时， 表明复合物存在解离。 凝胶必需完全聚合， 以避免带型拖尾。 如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反 应。在含抽提液的带中不含游离探针

51、或复合物，但只含探针的带中有探针表明抽提物有 核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。 中科院生物物理所 2014 年考试生物化学与分子生物学 一 、简答题 1.染色质是如何组装的？组蛋白有哪些修饰，并说明其特征和意义。染色质是如何组装的？组蛋白有哪些修饰，并说明其特征和意义。(略略) 组蛋白的修饰特征意义见现代分子生物学。 2.给出了约给出了约 10 个氨基酸个氨基酸，有有：V，T，F，D，E，S 等等，你按要求写出三肽你按要求写出三肽，并写出结构式并写出结构式， 侧链用侧链用 R1，R2，R3 表示。表示。A：疏水氨基酸：疏水氨基酸 B：酸性氨基酸：酸性氨基酸 C:碱性

52、氨基酸碱性氨基酸 3.细胞内膜系统的功能。细胞内膜系统的功能。 细胞内区室化是真核细胞结构和功能的基本特征之一，由于细胞内大量膜结构的存在， 从而大大提高了细胞生理生化反应的效率。细胞内膜系统包括内质网、高尔基体、溶酶体、 胞内体和分泌泡等， 这些细胞器在结构功能乃至发生上是彼此相互关联的动态整体， 因此称 为内膜系统。下面分别介绍各个组分的功能。 内质网：内质网是真核细胞中最普遍、最多变、适应性最强的细胞器。占膜系统的一半 左右。根据结构和功能，内质网可分为糙面内质网和光面内质网。糙面内质网的主要功能是 合成蛋白质，而光面内质网是脂质合成的主要场所。一般情况下光面内质网所占比例较小， 但在某

53、些细胞中非常发达。 在肝细胞中光面内质网很丰富， 是合成外输性脂蛋白颗粒的基地。 干细胞的光面内质网还含有一些酶， 起到解毒作用。 心肌细胞和骨骼肌细胞中含有发达的特 化的光面内质网，称为肌质网，是储存 Ca+的细胞器，对 Ca+有调节作用。在某些合成固醇 类激素的细胞如睾丸间质细胞中光面内质网的含量也很丰富， 其中含有制造胆固醇并进一步 产生固醇类激素的一系列的酶。 高尔基体：高尔基体是由大小不一、形态多变的囊泡体系组成的。高尔基体的主要功能 是将内质网合成的多种蛋白进行加工、 分类与包装， 然后分门别类的运送到细胞特定的部位 或分泌到细胞外。 内质网合成的脂质一部分也通过高尔基体向细胞质膜

54、和溶酶体膜等部位运 输。是细胞内大分子转运的枢纽或集散地。 溶酶体：溶酶体的功能是细胞内消化作用。清除体内无用的生物大分子、衰老的细胞器 以及衰老损伤和死亡的细胞； 在吞噬细胞中溶酶体可以降解吞噬细胞吞噬的病毒细菌， 起到 防御作用；此外，溶酶体还可以为细胞提供营养、参与分泌过程调节、一些组织器官特定的 程序性死亡退化、以及精子的顶体反应。 过氧化物酶体：在肝脏和肾脏细胞中，过氧化物酶体可以氧化分解血液中的有毒成分， 起到解毒的作用。如饮酒后几乎半数的酒精是在过氧化物酶体中被氧化成乙醛的。 4.DNA 有哪些修复方式有哪些修复方式。 （12 年第五题）年第五题） 见现代分子生物学。 5.真核转

55、录调控过程中的顺式作用元件和反式作用因子的功能？真核转录调控过程中的顺式作用元件和反式作用因子的功能？ 答：顺式作用元件(cis-actingelement)存在于基因旁侧序列中与结构基因串联能影响基因 表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、沉默子和绝缘子，它们的作用是参与基因 表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点，要与反式作用 因子相互作用而起作用而调控基因转录的精确起始和转录效率。 1、 启动子是原核操纵子中启动序列的同义语。真核基因启动子是 RNA 聚合酶结合位点 周围的一组转录控制组件，每一组件含 720bp 的 DNA 序列。TATA 盒是第一个被

56、发现的 真核蛋白质编码基因的核心启动子元件。TATA 盒通常位于转录起始点上游-25-30bp， 齐主要的功能是在决定启动子强度和转录起始位点中起重要作用。 2、 增强子是一类远程调控序列元件，激活蛋白因子通过与增强子序列结合，然后与辅 助激活蛋白因子相互作用帮助决定哪些基因将被开启并加快这些基因的转录速率。增强 子行使功能与方向和所处位置无关。 3、 沉默子 一类下调基因表达的元件，阻遏蛋白因子选择性的与沉默子结合，干扰激 活蛋白因子的功能，从而使基因转录减慢。 4、 绝缘子 又称边界元件，在增强子和启动子之间，能抑制增强子对下游基因转录的 激活。 反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在

57、各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶 基因转录效率的蛋白质。有时也称转录因子。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后， 可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用， 从而激活另一基因的转录。 可分为通用转 录因子、组织特异性转录因子和诱导性反式作用因子。 6.原核表达系统和真核表达系统的优缺点？（原核表达系统和真核表达系统的优缺点？（2013 年第三题）年第三题） 二、问答题 1.给出一段蛋白给出一段蛋白 A 的基因序列和的基因序列和 pET28a，pET28b，pET28c 的序列信息，有蛋白的序列信息，有蛋白 A 构建构建到到 pET28a 载体的重组质粒载体的重组质粒， （1）请将蛋白）

58、请将蛋白 A 基因构建到基因构建到 pET28b 的载体上，并且尽在的载体上，并且尽在 C 端带端带 有有 His 标签标签，设计引物设计引物，PCR，酶切酶切，酶连酶连，转化转化，详细阐述这些步骤详细阐述这些步骤。 （2）请将蛋白请将蛋白 A 基基 因构建到因构建到 pET28c 的载体上，并且尽在的载体上，并且尽在 N 端带有端带有 His 标签标签。 （3）给出一个蛋白胶的图，为单）给出一个蛋白胶的图，为单 独在原核表达系统中纯化人源蛋白独在原核表达系统中纯化人源蛋白 A 和人源蛋白和人源蛋白 B，想要获得二元复合物，根据图分析存，想要获得二元复合物，根据图分析存 在的问题，并写出三种解

59、决方案。在的问题，并写出三种解决方案。 蛋白胶图中信息：两个蛋白均有表达，但是都在沉淀中，并有少量杂带，上清中没有。蛋白胶图中信息：两个蛋白均有表达，但是都在沉淀中，并有少量杂带，上清中没有。 中科院生物物理所 2015 年秋季博士入学考试生物化学与 分子生物学试题（回忆版） 一、 简答 1、密码子的简并性、同义密码子、无义突变、错义突变密码子的简并性、同义密码子、无义突变、错义突变 （10 分）分） 简并性：一个氨基酸由一个以上的三联体密码编码的现象叫做密码子的简并性。 同义密码子：由于密码子具有简并性，一个氨基酸的密码子大多不止一个，这些密码子就为 同义密码子。 无义突变： 由于某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子突变为终止密码子， 从而使肽链 合成提前终止。 错义突变：是编码某种氨基酸的密码子经碱基替换以后,变成编码另一种氨基酸的密码子, 从而使多肽链的氨基酸种类和序列发生改变。 补充补充