课题3　分解纤维素的微生物的分离 (10)

1、,纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨；分布植物的根、茎、叶中；,纤维素生物燃料：最有希望替代石油能源,一、基础知识,1.纤维素,纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。,土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。,2.纤维素酶 纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。,一、基础知识,3、纤维素的分解,请用一个简单的实验来验证此问题,纤维素酶水解滤纸实验,1U表示1个酶活力单位，是

2、指在温度为25，其他反应条件，如pH等，均为最适的情况下，在1min内转化1mmol的底物所需的酶量。,底物：酶所作用和催化的化合物。,纤维素酶的作用对照实验,二、纤维素分解菌的筛选,1、筛选纤维素分解菌的方法_。该方法可以通过_反应直接筛选。,刚果红染色法,颜色,2、原理：刚果红可以与纤维素形成_，但不能和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被_分解后， 红色复合物无法形成，出现以_ 为中心的_，可以通过_ 来筛选纤维素分解菌。,红色复合物,纤维素酶,纤维素分解菌,透明圈,是否产生透明圈,实验原理,即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。,可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌

3、,(三)、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,将样品涂布到鉴别培养基,挑选菌落,什么样的环境取样?,培养的目的?,挑选什么样的菌落?,鉴别培养基的特点? 如何鉴别?,根据：微生物对生存环境的要求，到相应环境中去找；,目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物；,刚果红染色法,对比课题3与课题2实验流程， 说说它们的不同之处：,课题2土壤取样，直接稀释。,课题3土壤取样，选择培养， 增加纤维素分解菌浓度后，再稀释。,1、纤维素分解菌选择培养基属于_（固体、液体）培养基，原因是_,【资料二】选择培养,阅读资料二“选择培养”，回答以下几问题：,液体,没有添加琼脂,2、该

4、培养基对微生物_（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是 _,具有,能分解纤维素的微生物可利用纤维素作为碳源而大量繁殖；其他微生物繁殖被抑制,分布环境,1、土壤取样：,富含纤维素的环境中,操作步骤,生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。,原因,将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右的腐殖土壤中。,提示：自变量为培养基的种类，即普通培养基和选择培养基。可用牛肉膏蛋白胨

5、培养基与之对照,或者将纤维素改为葡萄糖。,A、旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基，原因是配方中无凝固剂（琼脂）,B、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用,说明：分析“纤维素分解菌的选择培养基配方”可知，该配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，因此其他微生物也能在该培养基中生长繁殖。只不过，由于酵母膏的含量极少，因此，只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖。,旁栏思考题为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？ 在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。,指微生

6、物的种类少了，而某些微生物的数量多了,将细菌涂布在只有 尿素做氮源的选择 培养基上,将细菌涂布在纤维素粉做主要碳源的 选择培养基上,固体培养基,液体培养基,筛选菌株,选择培养,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释101107倍。,3.梯度稀释,4.将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养 基上,（1）制备鉴别培养基:,（2）涂布平板： 将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布到平板培养基上，30倒置培养。,鉴别纤维素分解菌的培养基,(水溶性羧甲基纤维素钠),方法一：先 ，再加入刚果红进行颜色反应。 方法二：在 时就加入刚果红。,培养微生物,倒平板,5.刚果红染色法,挑选

7、产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。,两种刚果红染色法的比较：,在细菌分解尿素的化学反应 中，细菌合成的脲酶将尿素 分解成了氨，氨会使培养基 的碱性增强，pH升高。在培 养基中加入酚红指示剂，如 果pH升高指示剂会变红,刚果红可以与纤维素形成 红色复合物，当纤维素被 纤维素酶催化分解后红色 复合物无法形成，培养基 上就会出现以纤维素分解 菌为中心的透明圈,观察菌落周围是否有着色的 环带出现来鉴定尿素分解菌,观察菌落周围是否出现 透明圈来筛选纤维素分解菌,脲酶检测法,刚果红染色法,在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C 370C培养，可获得纯化培养。,6、纯化培养,四、结果分析与评价,1.培养基的制作是否合格 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。,四、结果分析与评价,2.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落 对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。 如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。 3.分离的结果是否一致 由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，不同同学也可