第九章 维生素类药.ppt

1、第九章 维生素类药物的分析,主讲：马 宁,目的与要求,掌握维生素A、 B1、 C、 D、 E的结构特点与化学性质； 掌握维生素A、 B1、 C、 D、 E鉴别反应； 掌握维生素A含量测定中紫外分光光度法测定原理与方法；维生素B1含量测定中非水溶液滴定法和硫色素荧光法的特点；维生素C含量测定中碘量法,2，6二氯靛酚法等方法的特点；熟悉维生素D及维生素E的含量测定方法。 熟悉特殊杂质的检查。,概 述,一、概念 维生素 1）维持人体正常代谢功能所必需的一类微量的生物活性物质，主要用于机体的能量转移和代谢调节。 2）大多数人体内不能自行合成,必须从食物中摄取。,二、化学结构： 醇、酯、酸、胺、醛，酚

2、三、分类 脂溶性维生素: VitA、D2、D3、E、K1 水溶性维生素: VitB族 (B1、B2、B6、 B12) VitC、叶酸、烟酸、烟酰胺,SECTION 1 CONSIDERATIONS,Vitamins are non-sugar, non-fatty, non-protein substances, but they are essential for normal metabolic function of body. Some vitamins can not be synthetized by mammalian(哺乳的) species themselves, only

3、be absorbed and stored intact(完整的) vitamins and provitamins(维他命源) of plant origin in foods that are consumed, and then convert enzymatically (酶)to vitamins in the intestinal wall.,water-soluble vitamin and fat-soluble vitamin fat-soluble vitamin vitamin A, D, E, K water-soluble vitamin vitamin B gro

4、up(such as B1, B2), nicotinic acid, pantothenic acid(泛酸), folic acid(叶酸), ascorbic acid,Classification:,In this chapter, we only discuss Vitamin A, E, B1, and C(ascorbic acid), brif the others, such as: Vitamin D groupsterol SbCl3 colorimetry Vitamin K12-methyl-1,4-naphthaquinone(萘醌) Ceric sulfate t

5、itration(after reduced) or UV-spectrophotography Vitamin B2stem nucleus, isoalloxazine(异咯嗪) ringUV-spectrophotography Nicotinic acid -COOH acid-base titration,Analytical method:,第一节 维生素A（Vitamin A）的分析,维生素A1活性最高， 维生素A2的生物活性是维生素A1的30-40%，维生素A3的生物活性是维生素A1的0.4%， 故通常所说的维生素A系指维生素A1。,第一节 维生素A（Vitamin A）的分析

6、,1、来 源 1）天然产物 主要来源于鲛类无毒海鱼肝脏中提取的脂肪油,即鱼肝油。从鱼肝油提取的VA多为各种酯类的混合物，其中主要为醋酸酯和棕榈酸酯。,2）人工合成产物 全反式维生素A醋酸酯 中国药典收载的VA是人工合成的VA醋酸酯结晶加精制植物油制成的油溶液，其制剂有VAD胶丸和VAD滴丸。,2、药典收载情况,一、结构和性质 （一）结构,H 维生素A醇,-COCH3 维生素A醋酸酯,-COC15H31 维生素A棕榈酸酯,维生素A 325.5 100% 新维生素Aa 328 75% 新维生素Ab 320.5 24% 新维生素Ac 310.5 15% 异维生素Aa 323 21% 异维生素Ab 3

7、24 24%,相对生物效价,1、具有UV吸收 2、存在多种立体异构化合物,环己烯,共轭多 烯侧链,存在多种立体异构化合物 具有UV吸收 易发生脱氢、脱水、聚合反应,1、具有UV吸收,2、存在多种立体异构化合物,（二）性 质,3、易发生脱氢、脱水、聚合反应,4、与三氯化锑发生呈色反应,5、溶解性：脂溶性,VitA2,VitA3,3、易发生脱氢、脱水、聚合反应,去氢维生素A,去水维生素A,O2,H+ 重排,O,O,VA酸,VA醛,呋喃型氧化物 （无生物活性）,H+,+,+,-H,去水VA（VA3）,丙烯型醇 遇酸易发生脱水反应,环氧化物,VitA醛,VitA酸,CHCl3,不溶于水 易溶于有机溶剂

8、和植物油等,二、鉴别反应,CHCl3,反应机理：VA与三氯化锑(SbCl3)中存在的亲电试剂氯化高锑（SbCl5）作用形成不稳定的蓝色正碳离子。,注意事项：反应需在无水、无醇条件下进行。,水可使SbCl3水解成SbOCl,乙醇可与正碳离子作用，使正电荷消失,溶剂：饱和无水三氯化锑的无醇氯仿溶液,2、紫外吸收特征,去水维生素A（A3）：6个共轭双键，其最大吸收波长向红移，在340390nm波长间出现3个最大吸收峰(348、367、389nm)。,维生素A：5个共轭双键，其无水乙醇液在326nm波长处有最大吸收。,去水维生素A,维生素A在盐酸催化下脱水生物VA3,3、薄层色谱法,BP USP 薄层

9、板：硅胶G 硅胶 展开剂：环已烷-乙醚（8：2） 显色剂：三氯化锑 磷钼酸 现 象： 蓝色斑点 蓝绿色斑点,三、含量测定,（一）紫外-可见分光光度法,利用维生素A醇和其醋酸酯分子中具多烯共轭体系结构，在325328nm处有选择性吸收峰，故可进行含量测定。,维生素A醋酸酯的环已烷溶液在328nm处有最大吸收，吸收系数：1530； 维生素A醇的异丙醇溶液在325nm处有最大吸收，吸收系数：1820； 由于维生素A中稀释用油与有关杂质也有吸收，干扰测定，所以采用三点校正法测定含量。,立体异构体 氧化产物及光照产物 合成中间体 去氢维生素A（VitA2） 去水维生素A（VitA3）,三点校正法三波长测

10、定法,1、原理：本法是在三个波长处分别测定吸收度根据校正公式计算吸收度A校正值后，再计算含量，故本法亦称“三点校正法”。,2、条件 （1）杂质的吸收在310-340nm波长范围内呈一条直线，且随波长的增大吸收度减小； （2）物质对光的吸收具有加和性。, 1 VitA的max（328nm） 2 和3 在1的两侧各选一点,3、波长选择,第一法：等波长差法： 1- 2= 3- 1,直接测定法：VA醋酸酯（纯度较高）,第一法,4、测定方法,eg:中国药典中测定VA醋酸酯， 1=328nm、 2=316nm、 3=340nm,规定值 差值,1、max在326-329nm之间，且分别计算5个波长处的差值均

11、不超过0.02，直接用测得的A328，用下述公式计算含量。,标示量%=A328D1900w/(W100L标示量) 100%,纯度 较高,2、最大吸收波长是否在326-329之间,计算吸收度比值之差是否超过0.02,第二法（皂化）,计算A328（校正）,A328,皂化,A328（校正）,A328,皂化,计算A值(一个或几个超过0.02),VitA胶丸的含量计算,？,5、生物效价及换算因数,1IU的VitA = 0.300ug的全反式维生素A醇 = 0.344ug的全反式维生素A醋酸酯,（1）生物效价的定义,维生素A含量是用生物效价表示 单位 IU/g（国际单位）,生物效价（IU/g）=吸收系数换

12、算因数,（2）换算因数的计算,1g维生素A醋酸酯相当的维生素A的国际单位数为,1g维生素醇相当的维生素A的国际单位数为,(VitA酯),(VitA醇),换算因子=IU/g/,1、判断法选择A A测定或A校正,2、求,3、计算效价,（3）计算,第二法（皂化法）：适用于维生素A醇 不能用第一法测定的样品，用第二法测定。 维生素A酯用醇制氢氧化钾加热皂化（水解），用乙醚提取，挥干溶剂，残渣用异丙醇溶解，测定含量。,测定对象： VitA醇,等吸收比法 300、310、325、334nm,最大吸收波长是否在323-327之间,A300/A325是否超过0.73,色谱法纯化,计算A325（校正），或A值,

13、计算A值,（1）基本步骤: 第一步 A选择 选择依据：所选A值中杂质的干扰已基本消除。,总结测定法,注意： C 为混合样品的浓度,第二步 求,第三步 求效价,换算因数由纯品计算而得：,第四步：求标示量,示例：VitAD胶丸中VitA的含量测定 精密称取本品(规格10000VitAIU/丸)装量差异项下（平均装量0.07985g/丸）的内容物 0.1287g 至50ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀；精密量取2.0ml，置另一50 ml量瓶中，用环己烷稀释至刻度，摇匀。以环己烷为空白，测定最大吸收波长为328nm，并在下列波长处测得吸收度为,A300 0.374 A316 ：0.592 A32

14、8 ：0.663 A340 ：0.553 A360 ：0.228,A300 /A328 ：0.555 A316/A328 ：0.907 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.811 A360/A328 ：0.299,求本品中维生素A的含量？,A300 /A328 ：0.564 A316/A328 ：0.893 A328/A328 ：1.000 A340/A328 ：0.833 A360/A328 ：0.344,0.555 0.907 1.000 0.811 0.299,+ 0.01 0.01 0 + 0.02 + 0.04, ,= = = = =,以A328（校正）计算含

15、量,三氯化锑比色法,（二）,优点 简便 快速,max 618nm620nm,标准曲线法,思考题,1）三点校正紫外分光光度法测定维生素A含量的依据（原理）是什么？ 2）三点校正紫外分光光度法测定维生素A醋酸酯含量时，校正公式是什么？换算因子是多少？写出测定其胶丸含量时标示量%的计算式。,HPLC,维生素B12为水溶性维生素，过量可直接通过尿液排出体外；注射过量的维生素B12可出现哮喘、荨麻疹、湿疹、面部浮肿、寒颤等过敏反应，也可能相发神经兴奋、心前区痛和心悸。,第二节 维生素B1的分析,氨基嘧啶环CH2噻唑环(季铵碱),（一）结构,一、结构与性质,还原性,1、溶解性 易溶于水；微溶于乙醇；不溶于

16、乙醚,2、硫色素反应,（二）性质,3、紫外吸收特性 4、与生物碱沉淀试剂反应 5、氯化物特性,1 溶解性：易溶于水，水溶液呈酸性 2 硫色素反应：噻唑环在碱性介质中开环，在与嘧啶环环合，经铁氰化钾等氧化剂氧化成具有荧光的硫色素。,（二）性质,3 盐酸液的246nm波长处测定吸收度，吸收系数为421。 UV 共轭双键 max = 246nm 4 碱性 嘧啶环 伯氨 噻唑环 季铵 1、可与酸成盐 2、与生物碱沉淀剂沉淀。 3、含量测定 非水碱量法,三、鉴别试验,1、硫色素反应,2、生物碱沉淀反应,3、与硝酸铅的反应,4、氯化物反应,VitB1 + NaOH,共热,Na2S,Na2S + Pb(NO

17、3)2,PbS2（黑色）,方法 取本品约5 mg，加氢氧化钠与正丁醇2.5ml，强烈振摇。放置分层，上面醇层显强烈兰色荧光。加酸消失，再加碱又重现。 专属性反应。,1、硫色素反应（鉴别与含量测定）,硫色素反应为VitB1的专属反应,NaOH,环合,环合,2H,硫色素,VitB1,H+,H+,H+,H+,2、沉淀反应,S元素反应,Cl-反应,（一）非水溶液滴定法（原料药）,三、含量测定,原 理,利用噻唑环上季铵和嘧啶环上氨基的弱碱性，在非水溶液中用高氯酸液滴定。,喹那啶红亚甲蓝 （紫红天蓝）,（二）紫外吸收（鉴别与含量测定）,VitB1分子结构中具共轭双键，在紫外区246nm处有最大吸收，可进行

18、鉴别与含量测定。,原 理,差示分光光度法,？,UV法,计算公式：,维生素B1片的测定，取20片称定。严细。称取细粉适量，相当于25 mg，置100ml量瓶中，取5ml，在定溶于100ml，246nm测。标准吸光系数421。注意所使用的溶剂。,（二）紫外可见分光光度法（维生素1片剂）,片剂,= 421,（每片）相当于标示量的%=,A = ECL,规格 g/片,g/100ml,ChP,维生素B1注射液的测定 取本品相当于B1 50mg，置200ml量瓶中，加水置刻度，取5ml，用盐酸定溶于100ml，246nm测，吸光系数421。,注射剂（每ml）相当于标示量的%=,规格 g/ml,ml,NaOH

19、,激发波长365nm 发射波长435nm,制备氧化试剂、对照品溶液、供试品溶液 测定方法：取40ml具塞试管3支或3支以上，各精密加入对照品溶液5ml，于其中2支（或2支以上)试管中迅速（12s）内加入氧化剂各3.0ml，在30s内加入异丁醇20.0ml，闭塞，剧烈振摇90s。于另一支试管中加3.5mol/l氢氧化钠溶液3.0ml以替代氧化剂，并照上述方法操作，作为空白。 另取3支或3支以上的相同试管，各精密加入供试品溶液5ml，照上述对照品溶液管的方法，同法处理。 于上述6支或6支以上试管中，各加入无水乙醇2ml，旋摇数s，待分层后，取上层澄清的异丁醇液约10ml，测定荧光强度。,（三）硫色

20、素荧光法,激发波长365nm 发射波长435nm,2、方法与计算,对照液,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,+ NaOH + 铁氰化钾 + 异丁醇 + NaOH + 异丁醇,供试液,S,d,A,b,5ml供试品溶液中维生素B1的ug数 ,硫色素反应为维生素B1所特有的反应，专属性强，虽非定量完成，但控制好一定的条件可用于定量测定。 注意（1）氧化剂需新鲜配制，并在4h内使用； （2）贮备液需避光冷藏，并在1个月内使用； （3）注意操作的平行性。,2、特点,灵敏度高，线性范围宽 代谢产物不干扰，适用于体液分析,（三）高效液相色谱法,（四）毛细管电泳法,L（+）抗坏

21、血酸（活性最高） D（-）异抗坏血酸（为前者5%） L（+）异抗坏血酸（无活性） D（-）抗坏血酸（无活性）,第三节 维生素C的分析,一、结构与性质,(一）结构,3、两个手性碳原子，有四个光学异构体,1、二烯醇强还原性,2、弱酸性（一元酸）,4、紫外吸收,（二）性质,1、性状 白色结晶或结晶性粉末；无臭，味酸；久置色渐变微黄，水溶液显酸性。,2、溶解性 易溶于水；略溶于乙醇；不溶于氯仿和乙醚。,3、旋光性 比旋度+20.50- +21.50,4、酸性,烯二醇结构,由于共轭效应的影响 C3OH pKa = 4.17 C2OH pKa = 11.5,故VC表现为一元酸，可与NaHCO3生成钠盐,、

22、水解性,aOH,a2CO3,酮酸盐,6、强还原性,二烯醇结构,（）,抗坏血酸 （有生物活性）,去氢抗坏血酸 （有生物活性）,二酮古洛糖酸 （无生物活性）,二酮基结构,50,7、具糖的性质,结构与糖类相似,8、紫外吸收特性,二、鉴别试验,1、氧化反应,（）与AgNO3反应,（）与2，6 - 二氯靛酚反应,（玫瑰色）,（无色）,（3）与碱性酒石酸铜反应,（4）与KMnO4反应,2、糖类的反应,3、紫外分光光度法 243nm,2、糖类的反应 USP,或盐酸,50,吡咯,（蓝色）,(糠醛),戊糖,3、 UV,0.01mol/L HCl,三、杂质检查,（一）溶液颜色与澄清度检查 Ch.P 采用控制吸光度

23、的方法控制有色杂质的量。 1、原料 取供试品3.0g，加水15ml，振摇使溶解，溶液应澄清无色；如显色，将溶液经4号垂熔玻璃漏斗滤过，照紫外可见分光光度法，在420nm的波长处测定吸光度，不得过0.03。 2、片剂：，在440nm的波长处测定吸光度，不得过0.07。 3、注射剂：，在420nm的波长处测定吸光度，不得超过0.06。,（二）铁和铜的检查,原子吸收光谱法,合格 b a- b,指示剂 淀粉指示液,（一）碘量法 1 原理,四 、含量测定,（一）碘量法,取本品约0.2g，精密称定，加新沸过的冷水100ml与稀醋酸10ml使溶解，加淀粉指示液1ml，立即用碘滴定液（0.05mol/L）滴定

24、，至溶液显蓝色，在30秒内不褪。每1ml碘滴定液(0.05mol/L)相当于8.806mg的C6H8O6。,2、测定方法,1、酸性环境 减慢VitC被O2氧化速度,2、新沸冷H2O 减免水中O2的干扰,3、立即滴定 减少O2的干扰,4、制剂测定时注意，注意消除辅料的干扰。,Na2S2O5 + H2O,2NaHSO3,NaHSO3 + CH3COCH3,3、讨论,USP,JP,（2）快速滴定 2min内,（1）酸性环境 HPO3-HAc,稳定VitC,防止其他还原性物质干扰,（3）剩余比色测定,（定量过量）,（测剩余染料）,（4）缺点,需经常标定,贮存一周,干扰多 氧化力较强,（四）高效液相色谱

25、法,（三）紫外-可见分光光度法,第四节 维生素D的分析,维生素D2结构式,一、结构与性质,1、结构,9，10开环的骨化醇（calciferol）或麦角骨化醇（ergocalciferol）,9，10开环的胆骨化醇（colecalciferol）,第四节 维生素D的分析,2、性质 1、性状 无色针状结晶或白色结晶粉末；无臭、无味：遇光或空气均易变质。 2、溶解性 在氯仿中极易溶解，在植物油中略溶，在水中不溶。,3、不稳定性 含多个烯键，性质不稳定，遇光或空气及其它氧化剂无发生氧化变质，使效价降低，毒性增强。 4、旋光性 VD2：6个手性碳，VD3：5个手性碳 二者均具有旋光性。 5、显色反应：甾

26、醇类共有反应 6、紫外吸收特性,二、鉴别反应,1,2,3,4,显色反应 1.与醋酐-浓硫酸反应 2.与氯化锑反应 3.其它,比旋度测定,其它 HPLC, TLC m.p., UV, IR,维生素D2 维生素D3的 区分反应,二、鉴别试验 （一）显色反应 1、与醋酐-浓硫酸反应 。 2、与三氯化锑反应 橙色 粉红色。,3、其他显色反应 三氯化铁 橙黄色 二氯丙醇 绿色 + 乙酰氯试剂 绿色,（二）比旋度鉴别 维生素D2在无水乙醇中比旋度为+102.5至+107.5，维生素D3为+105至+112。 （注意应于容器开启后30min内取样，并在溶液配制后30min内测定。） （三）其他鉴别方法 TL

27、C、HPLC法、制备衍生物测定熔点，UV、IR,（四）维生素D2、D3的区分反应 维生素D的96%乙醇溶液加乙醇和85%的硫酸， 维生素D2显红色，在570nm有最大吸收； 维生素D3显黄色，在495nm有最大吸收。,（一）麦角甾醇的检查 利用其与洋地黄皂甙生成沉淀，检查浑浊。 取10mg加90%乙醇2 ml，加洋地黄皂甙溶液2ml（取洋地黄皂甙20mg加90%乙醇2 ml，加热溶解制成）。混合，放18小时，不得浑浊和沉淀。 （二）前维生素D的光照产物 有光甾醇、速甾醇、5，6-反式维生素D。中国药典上未收载该项检查。,四、含量测定,HPLC 根据样品中干扰物质存在的情况选择三种不同方法测定。

28、 讨论：1、采用以硅胶为填充剂，流动相为非极性溶剂正己烷正戊醇（997：3）的正相高效液相色谱法，检测波长254nm。 2、避光，避免氧化。 3、皂化提取过程复杂。 4、内标可选用邻苯二甲酸二甲酯。,苯 二氢吡喃,第五节 维生素E的分析,一、结构与性质,（一）结构： 苯并二氢吡喃醇衍生物,苯环 + 二氢吡喃环 + 饱和烃链,Vit E (dl-Tocopheryl Acetate),*,*,*,生物效价 右旋体 ： 消旋体 = 1.4 ：10,（天然品）,（合成品）,chp规定 维生素E（消旋-生育酚醋酸酯）,（二）性质,2、溶解性 易溶于有机溶剂，不溶于水,3、紫外吸收特性 284nm,1、

29、性状 微黄色至黄色或黄绿色澄清的粘稠液体;遇光色渐变深。,吸收系数41-45。,（二）性质,4、水解性 酯键易水解（H+、OH-）,5、易氧化,对氧敏感，成-生育醌和-生育酚二聚体。,1、硝酸反应,二、鉴别试验,生育红（橙红色）,生育酚,HNO3,强氧化剂,取本品约30mg，加无水乙醇10ml溶解后，加硝酸2ml，摇匀，在75加热15分钟，溶液应显橙红色。,2、三氯化铁联吡啶反应,红色,（1） 原理 维生素E在碱性条件下，水解生成游离生育酚，经乙醚提取后，被三价铁氧化，二价铁与联吡啶生成红色配位离子。非专属性。,生育酚,对-生育醌,弱氧化剂,红色,（2 ）方法 取本品10 mg，加醇制氢氧化钠

30、试液2 ml，煮沸放冷，加水4 ml，乙醚 10 ml，取乙醚层，加2，2-联吡啶乙醇液，几滴，三氯化铁乙醇液几滴，应显血红色。,= 41.045.5,max = 284nm,min = 254nm,0.01%无水乙醇中,薄层板 硅胶G,展开剂 环己烷 -乙醚（4 ：1）,显色剂 硫酸（105 5）,VitE Rf = 0.7,5、气相色谱法,（一）酸度 检查制备过程中引入的游离醋酸。 取乙醇与乙醚各15ml，置锥形瓶中，加酚酞指示液0.5ml，滴加NaOH滴定液（0.1mol/L）至微显粉红色，加本品1.0g，溶解后，用NaOH滴定液（0.1mol/L）滴定，不得过0.5ml。,（二）游离生

31、育酚,利用游离生育酚的还原性，将硫酸铈还原成硫酸亚铈.,（二）游离生育酚,硫酸铈滴定液（0.01mol/L） 二苯胺（亮黄灰紫）,试剂,2、,（M生育酚= 430.8）,例,取本品0.10g，加无水乙醇5ml溶解后，加二苯胺试液1滴，用硫酸铈液（0.01mol/L）滴定，消耗硫酸铈液（0.01mol/L）不得过 1.0ml。,2.15,药典规定,消耗硫酸铈液（0.01mol/L）1.0ml,设：应消耗硫酸铈液 V ml,0.011.0 实际浓度 V,若硫酸铈液浓度不是0.01000mol/L， 应重新计算硫酸铈的消耗量,例 Ce(SO4)2 = 0.01020mol/L,四、含量测定,1、GC法,选择性好 灵敏度高 速度快 分离效能好,挥发性低、不稳定、极性强衍生化易受样品蒸气压限制,特点,载气N2 固定液硅酮（OV-17） 担体硅藻土或高分子多孔小球 柱温265 检测器氢火焰离子化检测器(FID) 内标正三十二烷 n 500 R2,内标法加校正因子,内标法,供试液（样品+内标）,内标物,对照液（对照+内标）,校正因子：,实际工作中的计算方法,内标液 取正三十二烷加正己烷溶解并稀释成1