第3章 高效液相色谱分析.ppt

1、,仪器 分析,第三章 高效液相色谱分析,High-Performance Liquid Chromatography，HPLC,3.1 高效液相色谱法的特点 3.2 影响色谱峰扩展及色谱 分离的因素 3.3 类型及分离原理 3.4 高效液相色谱法的应用,目录,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种新型分离分析技术，已成为化学、生物化学与分子生物学、农业、环保、商检、药检、法检等学科领域与专业最为重要的分离分析技术。 它在技术上采用了高压泵、高效（化学键合）固定相和高灵敏度检测器，具备高压、高速、高效的特点。,3.1 高效液相色谱法的特点,固定相柱内填料或固定液 流动相洗脱

2、剂 HPLC是利用样品中的溶质在固定相和流动相之间分配系数的不同，进行连续的无数次的交换和分配而达到分离的过程。,液相色谱的基本原理,液相色谱的特点：,流动相为液体,通常在室温下操作,流动相的组成随时间而改变,操作基本流程,1高压输液系统,2进样系统,3 色谱系统,4. 检测器,4检测系统,流动相的组成随时间而改变,高效液相色谱仪,高效液相色谱仪,高效液相色谱与气相色谱的对比 相同点： 基本原理、基础理论相同 不同点： 分析对象、流动相、操作条件的差异,气相色谱法,高效液相色谱,高效液相色谱与气相色谱的比较,高效液相色谱与气相色谱的比较,固定相 流动相,1 传质快 2 寿命长 3 耐水、耐光、

3、 耐有机溶剂，稳定 4 选择性好 5 有利于梯度洗脱,1 样品有合适的极性和良好的选择性 2 与检测器匹配 3 高纯度 4 化学稳定性好 5 低粘度（粘度适中）,3.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素,基础 理论,热力学理论：塔板理论平衡理论 动力学理论：速率理论Vander方程,在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即： H = A + Cu,液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。,液体的粘度比气体大100倍，密度为气体的1000倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。,由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。,液相色谱中不可能

4、通过增加柱温来改善传质。恒温。,改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。,1 选粒径小的、分布均匀的球形固定相 （dp10m） 2 选粘度小的流动相。 3 在一定范围内减小流速。 4 选室温250C左右 5 提高装柱技术，能使涡流扩散项减小， 提高柱效。,液相色谱分离的条件：,柱内展宽因素 涡流扩散 传质阻力（主要因素）,柱外展宽因素 进样器、连接管 检测器体积,3.3 高效液相色谱法的类型及分离原理,高效液相色谱法,一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂。 流动相：各种不同极性的一元或多元溶

5、剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性。,二、液液分配色谱法（LLC）,固定相与流动相均为液体（互不相溶） 固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法） 化学键合相：通过化学反应键合到硅胶表面 正相色谱固定液极性 流动相极性 极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱 反相色谱固定液极性 流动相极性 极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱,三、离子交换色谱（IEC）,固定相：阴、阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液。 基本原理：组分在固

6、定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,四、离子对色谱（IPC),原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配。 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子。 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子。,五、空间排阻色谱色谱(SEC),固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子出峰最慢；中等分子中速通过；而大分子被排斥在外

7、，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离。,分离方法的选择,相对分 子质量,溶解度,离子型化合物，首先用离子交换色谱 异构体的分离可用液固色谱法； 不同官能团、同系物用液液分配色谱 高分子聚合物，用空间排阻色谱法。,小于200 气相色谱 200 2000 液固吸附、液-液分配 、 离子交换色谱法。 高于2000 空间排阻色谱,水溶性：离子交换色谱、液液分配色谱 油溶性和非极性的混合物：液-固色谱,化学结构,思考题： 1、液相色谱中，影响色谱峰展宽的主要因素是 A、纵向扩散 B、涡流扩散 C、传质阻力 D、柱前展宽 2、

8、对于能迅速溶于水的试样，宜选用的液相 色谱是 A、正相液液色谱 B、反相液液色谱 C、液固吸附色谱 D、空间排阻色谱,C,B,3、对溶于水或非水溶剂，分子大小有差别的试样，宜选用的液相色谱是 A、液液色谱 B、液固色谱 C、空间排阻色谱 D、离子交换色谱 4、对于能溶于酸性或碱性水溶液的试样，宜选用的液相色谱是 A、液液色谱 B、液固色谱 C、空间排阻色谱 D、离子交换色谱,C,D,1、利用其高柱效有效分离极复杂体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基 酸、常

9、见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。 4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。,3.4 高效液相色谱法的应用,在食品分析中的应用 1食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、有机酸（邻苯二甲酸、柠檬酸、苹果酸等）、有机胺、矿物质等； 2食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂（合成色素如柠檬黄、苋菜红、靛蓝、胭脂红、日落黄、亮蓝等）、抗氧化剂等； 3.食品污染物分析：霉菌毒素（黄曲霉毒素、黄杆菌毒素、大肠杆菌毒素等）、微量元素、多环芳烃,在生命科学中的应用 1. 低分子量物质,如氨基酸、有机酸、有机胺、类固醇、卟啉、糖类、维生素等的分离和测定。 2. 高分子量物质, 如多肽、核糖核酸、蛋白质和酶（各种胰岛素、激素、细胞色素、干扰素等）的纯化、分离和测定。 在医学检验中的应用 1.合成药物：抗生素、抗忧郁药物（冬眠灵、氯丙咪嗪、安定、利眠宁、苯巴比妥等）、黄胺类药等。 2.