生物化学第四章　酶（下）.pptx

1、2020/7/23,1,第三节酶代谢动力学,2020/7/23,2,一 研究内容： 酶促反应动力学研究酶促反应的速度以及影响速度的各种因素的科学。 酶促反应的影响因素主要包括酶的浓度、底物的浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等。,2020/7/23,3,二、影响反应速度的因素 (一)酶的浓度,2020/7/23,4,2020/7/23,5,当底物浓度较低时,反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,2020/7/23,6,随着底物浓度的增高,反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。,2020/7/23,7,当底物浓度高达一定程度,反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应。,2020/7

2、/23,8,（二）.底物浓度S 1.酶促反应速度V与底物浓度S的关系,2020/7/23,9,底物浓度对反应速度的影响,单底物、单产物反应 酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示 反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5以内）时的反应速度 底物浓度远远大于酶浓度,2020/7/23,10,2.Michaelis-Menten方程和米氏常数,1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米氏方程。,2020/7/23,11,Michae

3、lis 与 Menten 发展出酶作用动力学,Michaelis,Menten,Nelson Km值小表示亲和程度大,酶的催化活性高。 （同一种酶有几种底物就有几个Km值，其中Km值最小的底物一般称为该酶的最适底物或天然底物）,2020/7/23,22,2.3米氏常数的测定 （1）s-v （2）双倒数作图法,2020/7/23,23,从米氏方程中求得：当反应速度达到最大反应速度的90%，求底物浓度,90%V =100%VS/(km +S),即 S = 9km,在进行酶活力测定时，通常用4km的底物浓度即可。,计算一定速度下底物浓度,2020/7/23,24,（三）pH的影响 大部分酶的pH-酶

4、活曲线是钟形曲线 在一定的pH值活力最高，称最适pH。,pH稳定性：在一定pH范围内酶是稳定的,pH对酶作用的影响机制： 1.环境过酸、过碱使酶变性失活； 2.影响酶活性基团的解离； 3.影响底物的解离。,2020/7/23,25,2020/7/23,26,（四）温度的影响 酶活随温度变化的曲线是钟形曲线，有一个最高点，即最适温度,一方面是温度升高,酶促反应速度加快。 另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。 因此大多数酶都有一个最适温度。 在最适温度条件下,反应速度最大。,2020/7/23,27,高温两种不同影响：1.温度升高，反应速度加快；2.温度升高，

5、酶热变性速度加快。,最适温度,低温影响：1.温度降低，酶活性降低 2.温度过低,酶无活性但不变性,2020/7/23,28,（五）激活剂的影响 凡是能提高酶活性的物质都称为激活剂。大部分激活剂是离子或简单有机化合物。按照分子大小，可分为三类： 1.无机离子 金属离子：K+，Na+ ， Ca2+ ， Mg2+ ，Zn2+ ， Fe2+ 阴离子： Br- Cl- I- CN- PO34- 2.中等大小有机分子：还原剂、EDTA 3.蛋白质 这些离子或分子可与酶分子上的氨基酸侧链基团结合，可能是酶活性部位的组成部分，也可能作为辅酶或辅基的一个组成部分起作用。,2020/7/23,29,一般情况下，一

6、种激活剂对某种酶是激活剂，而对另一种酶则起抑制作用； 对于同一种酶，不同激活剂浓度会产生不同的作用。,应用激活剂时应注意,2020/7/23,30,（六） 抑制剂（inhibitor） 使酶活力下降，但不引起酶蛋白变性的作用称为抑制作用。 能引起抑制作用的物质叫做酶的抑制剂。 抑制剂与酶分子上的某些必需基团反应，引起酶活力下降，甚至丧失，但并不使酶变性。 酶的抑制剂一般具备两个方面的特点： a.在化学结构上与被抑制的底物分子或底物的过渡状态相似。 b.能够与酶以非共价或共价的方式形成比较稳定的复合体或结合物。,2020/7/23,31,抑制作用根据可逆性可分为两类： 可逆抑制 不可逆抑制。 表

7、示方法： 抑制分数,2020/7/23,32,抑制作用的类型,非专一性不可逆抑制 不可逆抑制作用 专一性不可逆抑制 抑制作用 竞争性抑制 可逆抑制作用 非竞争性抑制 反竞争性抑制,2020/7/23,33,1.可逆抑制剂 与酶的结合是可逆的，可用透析法除去抑制剂，恢复酶活。 根据抑制剂与底物的关系，可逆抑制可分为三种： 竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制,2020/7/23,34,（1）竞争性抑制,2020/7/23,35,2020/7/23,36,2020/7/23,37,特点： 抑制剂结构与底物类似，与活性中心结合，二者竞争酶的结合部位; 抑制剂与底物结合部位相同，酶活性降低 抑制剂浓

8、度与其抑制程度成正比，但通过增加底物浓度可以使抑制程度减小 动力学参数： Km增大 Vmax不变， 双倒数直线相交于纵轴,2020/7/23,38,草酸盐,草酰乙酸,丙二酸,戊二酸,琥珀酸盐,2020/7/23,39,2020/7/23,40,（2）非竞争性抑制,2020/7/23,41,2020/7/23,42,2020/7/23,43,非竞争性抑制作用：底物和抑制剂同时与酶结合，但形成的EIS不能进一步转变为产物。,无 I,V/2,km,有 I,(),2020/7/23,44,实例：重金属离子（Cu2+、Hg2+、Ag+、Pb2+） 金属络合剂（EDTA、F-、CN-、N3-）,2020/

9、7/23,45,b.非竞争性抑制,非竞争性抑制剂,无抑制剂,-1/km,1/v,1/Vmax,加入非竞争性抑制剂后，Km 不变，而Vmax减小。,1/s,2020/7/23,46,特点： 酶可以同时与底物和抑制剂结合，引起酶分子构象变化，并导至酶活性下降，两者结构不同，没有竞争。 与酶活性中心以外的基团结合，(大部分与巯基结合)，不与底物竞争酶的活性中心； 抑制剂浓度与其抑制程度成正比，但不能通过增加底物浓度使抑制程度减小，如某些金属离子（Cu2+、Ag+、Hg2+）以及EDTA等，通常能与酶分子的调控部位中的-SH基团作用，改变酶的空间构象，引起非竞争性抑制。 动力学参数：Km不变, Vma

10、x变小， 双倒数直线相交于横轴,2020/7/23,47,（3）反竞争性抑制,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合，引起酶活性下降。,2020/7/23,48,(3)、反竞争性抑制作用,酶与底物结合后抑制剂才能和酶 结合,2020/7/23,49,2020/7/23,50,特点： 酶必须与底物结合后才能与抑制剂结合 与酶活性中心以外的基团结合 抑制程度与I及S均成正比，不能通过增加底物浓度使抑制程度减小 动力学参数： Km、 Vmax均变小， 双倒数直线是一组平行线,2020/7/23,51,2020/7/23,52,有无抑制剂存在时酶促反应的动力学方程,2020/7/23,53,2.不可逆

11、抑制(irreversible inhibition) : 此类抑制剂通常以共价键与酶结合，不能用透析、超滤等方法除去。如低浓度的重金属离子Hg2+、Ag+、As3+ 可与酶分子SH结合，使酶活抑制。 按抑制剂的选择性，又可分为： 专一性与非专一性不可逆抑制剂。,2020/7/23,54,（1）非专一性不可逆抑制剂：抑制剂作用于酶分子中的一类或几类基团，这些基团中包含了必需基团，因而引起酶失活。 有机磷化合物 有机砷、汞化合物 与巯基作用，抑制含巯基的酶。 氰化物、CO 重金属 银、铜、铅、汞等盐类 烷化剂 主要是含卤素的化合物 还原剂，氧化剂，酰化剂,2020/7/23,55,路易士气,巯基

12、酶,失活的酶,2020/7/23,56,重金属盐引起的巯基酶中毒可用二巯基丙醇（BAL）解毒。,BAL,2020/7/23,57,农药敌百虫、敌敌畏、1059等有机磷化合物能特异地与胆碱酯酶（Choline esterase）活性中心丝氨酸残基的羟基结合，使酶失活。,有机磷化合物,羟基酶,失活的酶,2020/7/23,58,敌百虫,敌敌畏,有机磷杀虫剂,2020/7/23,59,乙酰胆碱为生物体内传递神经冲动的重要物质。胆碱酯酶为羟基酶，有机磷杀虫剂中毒时，此酶活受抑制，结果造成乙酰胆碱的堆积，造成神经过度兴奋直至抽搐而死。可用解磷定来治疗。,2020/7/23,60,（2）专一性不可逆抑制剂

13、：这类抑制剂选择性很强，它只能专一性地与酶活性中心的某些基团不可逆结合，引起酶的活性丧失。 Ks 型 （根据S结构设计）具底物类似结构，可与酶结合，带活泼化学基团，能修饰酶分子中的必需基团反应 主要取决于Ks 之比 Kcat 此类抑制物不但和S相似。且本身亦是酶的底物，具有潜伏的反应基团，在酶对其修饰时活化，作用于酶的活性部位，使酶不可逆失活，亦称自杀性底物,2020/7/23,61,第五节酶活性的调节,生物体内的各种生理活动均以一定的物质代谢为基础。为了适应某种生理活动的变化，需要对一定的代谢活动进行调节。 通过对酶的催化活性的调节，就可以达到调节代谢活动的目的。,2020/7/23,62,

14、限速酶或关键酶：可以通过改变其催化活性而使整个代谢反应的速度或方向发生改变的酶就称为限速酶或关键酶。 调节方式： 调节酶的活性(快) 调节酶的数量(慢),2020/7/23,63,一、酶活性的调节 （一）别构(变构)调节 1.定义：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后发生构象的改变，进行改变酶的活性状态，称为别构调节。 别构酶：具有别构作用的酶：亦称变构酶，由两个以上亚基组成，除了具有与底物结合的活性中心外，还具有与调节剂结合的调节中心。当酶与调节剂结合后，酶蛋白的构象发生变化，从而引起酶活性的变化。 别构剂：能使酶发生别构作用的物质,2020/7/23,64,2.分类：,2020

15、/7/23,65,当变构酶的一个亚基与其配体（底物或变构剂）结合后，能够通过改变相邻亚基的构象而使其对配体的亲和力发生改变，这种效应就称为变构酶的协同效应或变构效应。,2020/7/23,66,2020/7/23,67,3 判断 用饱和比值Rs（CI：协同指数）来表示： Rs81 1/n n:代表协同系数（Hill系数） 正协同效应:n1 RS81,位点被90%饱和时的底物浓度,位点被10%饱和时的底物浓度,2020/7/23,68,4.别构酶的特点 （1）一般是寡聚酶，由多亚基组成，包括结合部位、催化部位和调节（别构）部位，即活性中心和别构中心 （2）具有别构效应。指酶和一个配体（底物，调节

16、物）结合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。酶活性的改变通过酶分子构象的改变而实现；酶的变构仅涉及非共价键的变化；为一非耗能过程；无放大效应。 动力学 （3） K型效应物与V型效应物S0.5 K0.5 （4）脱敏作用:别构酶经加热或用化学试剂等处理，可引起别构酶解离，失去调节活性，称脱敏作用（desensitization）脱敏后的酶表现为米氏酶的双曲线。,2020/7/23,69,别构酶常为多个亚基构成的寡聚体，具 有别构效应，动力学曲线为形。,变构酶的形曲线,70,别构模型 （1）协同模型 （对称模型、齐变、WMC模型） 1965年由Monod、Wyman和Changeux提出。,

17、2020/7/23,71,要点： 亚基组成数目确定，地位相同，对称 每个亚基只有一个结合位点 每种亚基有两种状态，无杂合状态 变构后对称不变,2020/7/23,72,序变模型 （KNF模型） 1966年由Koshland、Nemethy和Filmer提出。,2020/7/23,73,要点： 配体与亚基结合后才诱导状态的改变，配 体不在时只有一种构象状态 构象改变序变进行，存在杂合态 效应可正可负,2020/7/23,74,举例：天冬氨酸转氨甲酰酶(ATCase),2020/7/23,75,（二）共价调节 在其他酶的催化作用下，某些酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而

18、使酶在活性形式与非活性形式之间相互转变，此过程称为共价修饰。,2020/7/23,76,常见类型 磷酸化与脱磷酸化（最常见） 乙酰化和脱乙酰化 甲基化和脱甲基化 腺苷化和脱腺苷化,2020/7/23,77,1共价修饰的机制：,共价修饰酶通常在两种不同的酶的催化下发生共价修饰（covalent modification）或去修饰，从而引起酶分子在有活性形式与无活性形式之间进行相互转变。,2020/7/23,78,-O-PO32-,酶蛋白的磷酸化修饰与去修饰,2020/7/23,79,2共价修饰调节的方式：,共价修饰调节一般与激素的调节相联系，其调节方式为级联反应(cascade reaction

19、)。,2020/7/23,80,共价修饰酶的级联反应,2020/7/23,81,3共价修饰调节的特点：, 酶以两种不同修饰和不同活性的形式存在； 有共价键的变化； 受其他调节因素（如激素）的影响； 一般为耗能过程； 存在放大效应。,2020/7/23,82,（三）酶原激活 酶原从前体蛋白质变成活性酶的过程称为酶原激活 酶原：酶无活性的前体。 酶原的激活 ：从无活性的酶原转变为有活性 的酶的过程。 激活剂 ：能使无活性的酶原激活的物质。 酶原激活的本质：酶原的激活实质上是酶活性部位形成或暴露的过程。 糜蛋白质酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶。 酶原激活的生理意义在于：保护自身组织细胞不被酶水解消化

20、。,2020/7/23,83,酶原激活的机理,2020/7/23,84,胰蛋白酶原的激活过程,2020/7/23,85,2020/7/23,86,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,六肽,肠激酶,胰蛋白酶对各种胰脏蛋白酶的激活作用,2020/7/23,87,二、酶数量的调节 （一）合成速度调节 结构酶：指正常细胞内存在的酶，它的含量较稳定，受外界因素影响很小。 主要受基因和代谢双重调控 诱导酶： 在正常细胞中含量极少或没有，当细胞中加入特定诱导物后，诱导产生的酶，含量在诱导物存在下显著增高，诱导物往往是该酶的底物或底物类似物.,2020/7/23,88,凡能促使基因转录增强，从而使酶蛋白合成增加的物质就称为

21、诱导剂；反之，则称为阻遏剂。 1代谢物的调节： 2激素的调节： （二）降解速度的调控：通过调节酶的降解速度以控制酶的活性。,2020/7/23,89,三、同工酶 定义：指有机体内能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构、性质及至免疫学性质均不相同的一组酶。存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织中，甚至同一组织、同一细胞中。 类别：1 原级同工酶,由于酶蛋白编码基因不同而产生的同工酶称原级同工酶; 2 次级同工酶:由于基因转录产物mRNA或者其翻译产物经过不同的加工过程产生的同工酶称次级同工酶。 同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要。,2020/7/2

22、3,90,乳酸脱氢酶（LDH),同工酶的典型代表,2020/7/23,91,乳酸脱氢酶同工酶形成示意图,2020/7/23,92,不同组织中LDH同工酶的电泳图谱,2020/7/23,93,心肌中以LDH1含量最多，LDH1对乳酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化乳酸转变为丙酮酸再进一步氧化分解，以供应心肌的能量。 在骨骼肌中含量最多的是LDH5，LDH5对丙酮酸的亲和力较高，因此它的主要作用是催化丙酮酸转变为乳酸，以促进糖无氧酵解的进行。,乳酸脱氢酶同工酶的生理意义：,2020/7/23,94,同工酶在各学科中的应用,(1) 遗传学和分类学：提供了一种精良的判别遗传标志的工具。,(2) 发

23、育学：有效地标志细胞类型及细胞在不同条件下的分化情况，以及个体发育和系统发育的关系。,(3) 生物化学和生理学：根据不同器官组织中同工酶的动力学、底物专一性、辅助因子专一性、酶的变构性等性质的差异，从而解释它们代谢功能的差别。,（4）医学和临床诊断：体内同工酶的变化，可看作机体组织损伤，或遗传缺陷，或肿瘤分化的的分子标志。,2020/7/23,95,四、抗体酶 也叫催化性抗体（catalytic antibody），是一种具有催化功能的抗体分子。,五、模拟酶,模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物。,2020/7/23,96,第

24、六节酶活力及酶工程 一、酶活力： 1.定义： 用在一定条件下，酶催化某一反应的反应速度表示。反应速度快，活力就越高。 表示方法：单位时间、单位体积中底物的减少量或产物的增加量。,2020/7/23,97,2.国际酶学会标准单位： (1)IU 在特定条件下，1分钟内能转化1mol底物所需的酶量，称一个国际单位（IU）。特定条件：25 pH及底物浓度采用最适条件 (2) Kat (也称催量单位) 1972年在最适条件下，每秒钟能催化1mol底物转化为产物所需的酶量规定为1 Kat单位,2020/7/23,98,3.其他表示方法,(1)酶的比活力 (Specific activity) 每毫克酶蛋白

25、所具有的酶活力。酶的比活力是分析酶的纯度是重要指标。,单位：U/mg蛋白质。 有时用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少个活力单位表示。,2020/7/23,99,(2)酶的转换数(TN) 亚基或催化中心活性定义：每mol 的活性亚基或 活性中心 在一秒内转化的底物 的mol 数，称为转换数TN。,2020/7/23,100,二、酶活力测定方法： （一）终点法： 测反应完成所需要的时间 （二）动力学方法 1.比色法 2.量气法 3.滴定法 4.分光法 5.放射法 6.酶偶联分析法 7.电化学法,2020/7/23,101,三、酶的纯度： 比活力 = 活力单位数/ 毫克蛋白（氮）,2020/7/23

26、,102,四、酶的分离纯化 具体过程：选材破碎抽提分离纯化,方法 1.根据溶解度不同:（盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、选择性沉淀法）； 2.根据酶与杂蛋白分子大小的差别； （凝胶过滤法、超离心法）； 3.根据酶和杂蛋白与吸附剂之间吸附与解吸附性质的不同（吸附分离法）；,2020/7/23,103,4.根据带电性质（离子交换层析法、电泳分离法、等电聚焦层析法）； 5.根据酶与杂蛋白的稳定性差别（选择性变性法）； 6.根据酶与底物、辅因子或抑制剂之间的专一性亲和作用（亲和层析法）。,2020/7/23,104,五、酶工程 主要内容：研究酶生产、纯化、固定化技术、酶分子的修饰和改造及工农业、

27、医药卫生等领域的应用，分化学酶工程及生物酶工程,（一）化学酶工程 天然酶 化学修饰酶 固定化酶,2020/7/23,105,酶的固定化就是把水溶性酶经物理（吸附法与包埋法）或化学方法（共价偶联法与交联法）处理后，使酶与惰性载体结合或将酶包埋起来成为一种不溶于水的状态。,吸附法：使酶被吸附于惰性固体的表面，或吸附于离子交换剂上。,包埋法：使酶包埋在凝胶的格子中或聚合物半透膜小胶囊中。,偶联法：使酶通过共价键连接于适当的不溶于水的载体上。,交联法：使酶分子依靠双功能基团试剂交联聚合成“网状”结构。,2020/7/23,106,固定化酶,将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物(或载体)上

28、而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶(immobilized enzyme)。,共价偶联法,交联法,2020/7/23,107,化学酶工程 亦称初级酶工程 主要由酶学与化学工程技术相互结合而形成化学修饰 固定化处理 化学合成法 自然酶化学修饰酶固定化酶 化学人工酶,改善酶的性质以及提高催化 效率及降低成本,研究和应用,2020/7/23,108,固定化酶-指被结合到特定的支持物上并能发挥作用的一类酶。是化学酶工 程中具有强大生命力的主干。 四种方法：吸附 交联 共价结合 包埋 优点：（1）、可以用离心法或过滤法很容易地将酶与反应液 分离开来。在生产中十分 方便有利（2）、可以反复使用,达上千次,节约成本（3）、稳定性能好 人工酶-模拟酶的生物催化功能，用化学半合成法或化学全 合成法合成的酶称人工酶,2020/7/23,109,生物酶工程 在化学酶工程基础上发展起来的，是以酶学和DNA 重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物。 亦称高级酶工程。 三个方面：（1）用DNA重组技术大量地生产酶（克隆酶）（2）对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶（突变酶）（3）设计新的酶基因，合成自然界不曾有过的