电生理研究方法.ppt

1、第二章心肌电生理学研究方法，methodologyofmyocardiumelectrophysiologicalresearch，电生理学技术的发展，1825年电流校正的发明和应用，1922年电子管放大器和阴极射线示波器问世。 20世纪40年代微电极技术产生动作电位的纳金属钍学说20世纪50年代发生了电压钳技术，20世纪70年代发生了膜片钳技术、谢灵顿(1857-1952 )英吉利的神经生物学家。 发现中枢神经反射活动规律，阿德里安(Adrian ) (1889-1977 )英吉利的大姨妈学者。 阐明了动作电位及其传导规律，1932年获得诺贝尔奖，阿兰格(Erlanger) (1874-19

2、65 ) (美)两人合作发明了阴极示波器， 研究神经纤维功能的Bernstein提出了生物电产生的膜学说：“由于神经和肌肉的胞质膜对钾元素络离子有特殊的通透性，对大的阳络离子和阴络离子无通透性，细胞球内外的钾元素离子分布不均匀，膜的两侧形成了电位差即安静电位，神经冲击到来时， 膜变成无选择透过的膜，静定电位消失，络离子学说(动作电位的纳金属钍学说) 1940年前后，发现Hodgkin和Huxley在梅尔多伊卡斯的轴突上动作电位大于静定电位，因此对Bernstein膜学说造成了强烈打击。 今后的研究证实了Bernstein膜学说对于络离子渗透性的假设是不正确的。 被之后的络离子学说(纳金属钍学说

3、)所取代。Eccles、一九七九年德意志图谱生物物理化学研究所Neher和Sakmann首次在蛙肌细胞球用双电极固定膜电位和云同步中记录胆碱能系统(Acetylcholine，ACh )激活的单通道络离子电流，并膜片钳技术(patchclamp ) 1980年Sigworth等人获得了10-100G的高电阻封接(Gigaseal )，1981年Hamill和Neher等人改良了这一技术，引进了全细胞球记录技术，使这一技术进一步完善，1983年10月，单通道回收Neher Sakmann (1944-)(1942-) (德意志细胞球生理学家) (德意志细胞球生理学家)共同发明了膜片钳技术，并应用

4、该技术证明了胞质膜上存在络离子通道。 这一成果对于研究细胞球功能的特罗尔至关重要，可以揭示神经系统、肌肉系统、心血管系统及糖尿病等多种疾病的发病机制，为治疗提供新途径。 两人在1991年获得了诺贝尔奖。 内尔在实验室进行膜片钳研究，1983年10月第一版单通道记录封面，电大姨妈获奖医学诺贝尔奖名单(截止2002年)，第一节常规心肌电大姨妈研究技术，常规心肌，一，常用电大姨妈机器，刺激系统(刺激器等)检测系统振膜式传感器)放大系统(前置、后置放大器)记录显示系统(示波器、记录修正、计算机)、一.电子刺激器方形波(矩形波、square wave )的宽度、宽度、频率可分别调节，因此矩形波电子刺激器

5、成为理想的刺激源。SEN-7203、方波刺激脉冲的残奥仪表要求： (1)宽度(强度，amplitude )、矩形脉冲电压的最大瞬时值、(2)宽度(刺激持续时间time )、(3)(5)刺激方式(Pattern of stimulation )、单刺激、连续刺激、双脉冲刺激、(6)同步输出(Synchronized output )、同步脉冲表示一次刺激的时间起点的隔离器切断刺激电流从共同接地线泄漏的可能性，减小伪轨道消除50周交流感应对云同步的干扰作用。 2 .微电放大器构成axopatch200b(axopatch200b )，例如精密稳压电源、高输入阻抗探针、主放大器、电容补偿电路、校正电

6、路、低通滤镜电路等频率响应范围为0100Hz (3)低噪声50uV (4)高识别差(共模抑制比) 1000:1 (5)高输入阻抗1000M (6)次低频和射频波滤波器次低频3示波器(oscillograph )提供高灵敏度扫描扬声器类型：双重线示波器多线示波器长佑辉里肌肉扫描示波器存储示波器，VC-11，存储分析4电大姨妈实验结果的仪器，(1)示波器通用相机(2)录音带记录器A/D转换- -生物电(模拟计程仪)信号转换成数字信号D/a转换- -将数字信号转换为模拟计程仪信号，二细胞球外记录，细胞球外记录将电极置于心肌表面或附近以诱导心肌组织或细胞球的电活动。 适应范围： (1)长时间的实验；(

7、2)对冷静而自由活动的动物的研究；(3)从不同组织部位在云同步上创建多导向记录；(4)研究非常小的细胞球，数量多不易孤立，接触和穿刺容易损伤等；(5)研究脏器的总活动。 (1)玻璃微电极；(2)金属电极；(3)络离子选择性电极；(4)单极电极；(5)多管电极；(3)体心电活动的细胞球内记录有利于查明、微电极、心脏各种调节因子、病原因子或药物对心肌电大姨妈特性影响反应历程的缺点：记录不持续、影响因子多、四离体心肌电活动的细胞球内记录(intracellular recording in vitro )， 1实验装置2微电极、标准微电极、微推进器3浴池和灌注装置大姨妈盐溶液、混合瓦斯气体、摄氏30

8、度4刺激器5的应用范围的优点稳定，长时间记录，溶液成分7观察指标RP、APA、APD10、APD50、APD90， 可以任意改变Vmax的第二节：电压钳技术利用微电极技术来记录细胞球内的电变化过程，但不能弄清楚其变化的原因。 为了弄清跨膜电变化的反应历程，需要应用电压钳技术。 该技术首先由Cole及其同事修订，由Hodgkin等人改进，用于神经电大姨妈研究，揭示了神经纤维兴奋时络离子流动的情况。 另一方面，胞质膜的生物物理特性(biophysicalpropertiesofcellmembrane )，胞质膜主要由脂质和蛋白质组成。 以脂双分子层为心脏支架，埋入了不同特性的蛋白质粒子。 胞质膜

9、的电紧张及其扩散规律、膜的极化状态及其形成过程等是胞质膜线缆性质(cable properties )的反映。(拉力赛电阻和膜电阻、膜容量的组合，使电流对膜电位的影响随距离衰减，发挥时间延迟作用神经的“电缆”性质。 从确定的等效电路及其时间常数和空间常数以及例子证实了胞质膜的电缆特性。 (1)从电学特征分析，胞质膜的等效电路可等效地模拟为电阻电容器。 具有细胞球拉力赛电阻(纵电阻、ri )、膜电阻(横电阻、rm )、膜电容(Cm )和膜电位(em ) 4个电气特性，可以由这些个4个特性构成其等效电路(Equivalent Circuit )，可以是、outside， inside，膜电位等效电

10、路的简化图，Cm膜电容Rm膜电阻Em络离子平衡电位Ro细胞外液的纵电阻(/cm) Ri轴拉力赛的电位变化引起电容器的充放电，也可以用于电阻器中流过电流。 设通过电容器的电流为Ic，通过电阻的电流为Ir。 1纵向电阻(Ro，Ri )由细胞球浆的性质决定，具有高电阻率，与直径成反比(直径大，电阻小，直径小，电阻大)。 由于其存在，生物电的传导主要是沿着被胞质膜包围的容积导体进行的。 这是每单位长度的电阻，单位为/cm，细胞球外间质的容积大，其每单位长度的电阻(Ro )比Ri小。 2 .横向电阻，即，胞质膜本身具有的膜电阻。 胞质膜由二重碱脂构成，虽然厚度薄，但具有高电阻，即绝缘性。 膜电阻表示络离

11、子通过膜的有限能力。 膜电阻反映了络离子是否容易透过膜。 膜电阻(Rm )的大小反映了膜结构的电学差异。 3 .膜电容(capacity )表示膜的绝缘及电荷蓄积的性质。 所有装置都是在两个导体的中间插入绝缘体进行配置，称为电容器。 细胞外液和细胞内液都是含有电解质的溶液，可以看作两导体的胞质膜是含有脂质的膜，可以看作绝缘体。 细胞外液胞质膜细胞内液三者构成了容量。 4膜电位(membrane potential )相当于当膜上的络离子通道断开而带电络离子越过膜流动时，对电容器充电或放电而超过电位差，即越过膜。 膜电位的高低由跨膜电化学梯度决定的膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。 5膜电流，任

12、何电流都以电容电流(Ic )和电阻电流(Ii )两种形式通过胞质膜，前者引起膜电荷的变化，后者实际上由络离子携带胞质膜。 I m=Ic Ii，(2)胞质膜的时间常数(time constant )，时间常数是指膜电压随时间变化的过程，用一定表示。 反映了膜电位在胞质膜上随时间变化(缓慢)的程度。 即，是根据膜电阻和膜容量将膜电位充电到63%或37 %所需要的时间。=Rm Cm=膜的时间常数(ms) Rm=膜电阻(k) Cm=膜电容(f )，(3)胞质膜的空间常数(space constant )，空间常数是指电压的空间衰减，即标识牌电压根据距离衰减的程度的常数。 使用第2节约用电压箝位技术、V

13、oltage clamp technique、微电极技术，记录细胞球内的电变化过程，但无法明确该变化的原因。 为了弄清跨膜电变化的反应历程，需要应用电压钳技术。 该技术首先由Cole及其同事修订，由Hodgkin等人改进，用于神经电大姨妈研究，揭示了神经纤维兴奋时络离子流动的情况。 另一方面，以胞质膜的生物物理特性(biophysicalpropertiesofcellmembrane )、胞质膜上脂质双分子层为心脏支架，埋入了不同特性的蛋白质粒子。 胞质膜的电紧张及其扩散规律、膜的极化状态及其形成过程等是胞质膜线缆性质(cable properties )的反映。(拉力赛电阻和膜电阻、膜容量

14、的组合，使电流对膜电位的影响随距离衰减，发挥时间延迟作用神经的“电缆”性质。 从确定的等效电路及其时间常数和空间常数以及例子证实了胞质膜的电缆特性。 (1)从电气特征来分析胞质膜的等效电路，可以将胞质膜等效地模拟为电阻电容器。 具有细胞球拉力赛电阻(纵电阻、ri )、膜电阻(横电阻、rm )、膜电容(Cm )和膜电位(em ) 4个电气特性，可以由这些个4个特性构成其等效电路(Equivalent Circuit )，可以是、outside， inside，膜电位等效电路的简化图，Cm膜电容Rm膜电阻Em络离子平衡电位Ro细胞外液的纵电阻(/cm) Ri轴拉力赛的电位变化引起电容器的充放电，也

15、可以用于电阻器中流过电流。 设通过电容器的电流为Ic，通过电阻的电流为Ir。 1纵向电阻(Ro，Ri )由细胞球浆的性质决定，具有高电阻率，与直径成反比(直径大，电阻小，直径小，电阻大)。 由于其存在，生物电的传导主要是沿着被胞质膜包围的容积导体进行的。 这是每单位长度的电阻，单位为/cm，细胞球外间质的容积大，其每单位长度的电阻(Ro )比Ri小。 2 .横向电阻，即，胞质膜本身具有的膜电阻。 胞质膜由二重碱脂构成，虽然厚度薄，但具有高电阻，即绝缘性。 膜电阻表示络离子通过膜的有限能力。 膜电阻反映了络离子是否容易透过膜。 膜电阻(Rm )的大小反映了膜结构的电学差异。 3 .膜电容(capacity )表示膜的绝缘及电荷蓄积的性质。 所有装置都是在两个导体的中间插入绝缘体