洗涤用酶制剂质量规格及测试方法第1部分：碱性蛋白酶编制说明

1、国家标准洗涤用酶制剂质量规范和试验方法第一部分：碱性蛋白酶的制备说明一.任务来源国家标准计划洗涤用酶制剂质量规格及测试方法 第一部分 碱性蛋白酶(计划编号20172651-T-607)于2017年12月15日正式发布，项目实施期为24个月。由TC272国家表面活性剂和洗涤产品标准化技术委员会报告并实施，主管部门为中国轻工业联合会。主要起草单位：中国日用化学研究院有限公司、深圳百吉美生物技术有限公司等。二、目的和意义洗涤工业是酶制剂最重要的应用领域之一。在世界上，每年生产的酶制剂有三分之一用于洗涤行业。在发达国家，向洗涤剂中添加酶已逐渐成为新产品开发的标准配置。从最新发布的中国洗涤用品行业发展“

2、十三五”规划中可以看出，中国洗衣粉中添加酶的比例高达80%。行业协会也在积极引导国内洗涤产品向液体化、浓缩化和绿色化方向创新发展。然而，由于缺乏统一的洗涤酶制剂标准，传统的加酶洗衣粉和新兴的含酶洗涤剂都缺乏权威的检测方法和监管依据，容易被不良企业用作概念炒作，与劣质产品低价竞争，从而破坏了新兴产品市场，打击了消费者的信任，抑制了行业优秀企业的积极性，阻碍了行业规划的发展进程。在此背景下，规范含酶洗涤产品市场，引导行业企业创新开发新产品，防止不法企业以假冒伪劣产品欺骗消费者，促进洗涤行业快速、良性、正常发展，对我国洗涤行业具有重要意义。碱性蛋白酶是目前洗衣粉中广泛使用的一种酶制剂，它能将蛋白质水

3、解成低分子量多肽和氨基酸，对日常生活中常见的蛋白质污渍，如蛋制品、乳制品、豆制品、肉制品和血液引起的污渍有很好的去除效果。特别是添加蛋白酶制剂的洗衣液对清洗国标蛋白脏布效果明显。因此，碱性蛋白酶是国内高端洗衣粉的主要酶制剂。在洗衣粉新产品开发中，越来越多的企业开始使用液体碱性蛋白酶。碱性蛋白酶质量规范和检测方法国家标准的建立，对监管和规范含碱性蛋白酶洗涤产品的营销具有重要的指导意义。第三，工作流程2017年12月至2018年4月，在标准方案获得批准后，对碱性蛋白酶测定方法的现状进行了调查。结合自身的实践经验和洗涤行业的要求，编制了洗涤用酶制剂质量规格和测试方法-第一部分 碱性蛋白酶国家标准(初

4、稿)。2018年5月，国家表面活性剂洗涤产品标准化中心在太原组织了一次洗涤用酶制剂相关标准研讨会，讨论标准初稿。诺维信、杜邦、Bagme等企业的代表参加了会议，对标准文本提出了许多意见和建议，形成了洗涤用酶制剂质量规格和测试方法-第一部分 碱性蛋白酶国家标准(第二稿)。会议决定，表面活性剂洗涤产品国家标准化中心应收集不同制造商的洗涤蛋白酶，并将其分发给诺维信、杜邦、巴格姆和英国工会。每个公司将安排两名检查员进行平行测定，并按照标准第二稿中规定的方法进行测试和比较。从2018年5月至2019年10月，使用标准化中心提供的样品对试验方法进行了验证和改进。在实验过程中，针对存在的问题，我们通过电子邮

5、件、微信群和电话会议进行了多次沟通。在总结前期工作的基础上，我们编制了国家标准洗涤用酶制剂质量规格和测试方法-第一部分 碱性蛋白酶(第三稿)，并在此基础上形成了本咨询稿。四.标准编制的原则和主要内容(一)标准编制的原则本文件根据国标1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则编制。该文件参照国标23527-2009 蛋白酶制剂和国标34800-2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法。在建立方法的过程中，尽量采用酶制剂生产厂家和洗涤剂生产厂家检测实验室常用的分析技术和仪器，选择准确、可行、易操作的分析条件，保证检测方法的可操作性和重复性。(二)标准的主要内容本文件主要包

6、括以下八个部分和附录：(1)范围(2)规范性参考文件(3)术语和定义(4)要求(5)试验方法(6)检验规则(7)标记、包装、运输和储存(8)保质期附录a:福林法测定碱性蛋白酶活性附录b:碱性蛋白酶活性的测定紫外分光光度法附录三：粒度的测定筛选法V.主要内容描述本文件首次制定，确立了产品标准，确立了产品的重要检测方法：蛋白酶活性的测定方法和蛋白酶粒径的测定方法。产品指标及相关要求如下：1.感官要求由于发酵原因，不同批次的市售洗涤剂蛋白酶之间存在一定差异，无论是液体还是固体，但是产品的颜色对酶活性水平没有影响。因此，本标准规定了产品在颜色、气味和状态方面的感官要求，并有广泛的变化。同时，根据洗涤剂

7、行业的特点，固体产品可以根据客户要求制成各种颜色。2.物理和化学要求酶活性是产品的重要理化指标。为了向消费者提供证据，标准中规定了20，000的最低值。但同时，酶活性也是一个商业指标，制造商可以根据客户的要求生产各种具有酶活性的产品。建议在合同中规定这个值。对于固体产品，规定了最小粒度指数。根据GB 30000.21-2013 化学品分类和标签规范第21部分：呼吸道或皮肤致敏，酶被归类为呼吸性过敏原。由于灰尘大，粉末产品容易对酶过敏。鉴于粉尘产品的巨大安全隐患，容易引起操作者和最终消费者的过敏，因此不建议将其用于洗涤剂中。洗涤剂中的酶产品通常是颗粒状产品，通过制粒过程进行包衣。通过将样品检测与

8、制造商的默认指数进行比较，确定该值为150米0.5%。3.检测方法测试方法包括紫外分光光度法和福林法。根据国标23527-2009 蛋白酶制剂和国标34800-2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法，对现有方法进行了优化，形成了新版本的酶活性检测方法。对于固体酶制剂，增加了粒度检测方法。4.保存限期规定固体制剂和液体制剂应在25以下，保质期不得少于12个月。货架期内测得的酶活性不应低于20，000或制造商提供的标记酶活性，表明货架期外的酶仍有使用价值，使用时应重新测定酶活性。六.检测方法的建立和验证(一)酶活性检测方法1.方法介绍本标准所引用的碱性蛋白酶活性分析方法是基于GB/T 23527-

9、2009 蛋白酶制剂和GB/T 34800-2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法，仅根据该方法多年应用中的经验和问题进行了修订。在修订过程中，考察了福林试剂标准曲线的测定方法、标准曲线上不同范围内酶活的差异、不同测试人员对福林试剂标准曲线K值的差异、样品的稀释方式和处理方式。通过统计分析验证了蛋白酶活性测定的方法。本报告中的所有统计分析都源于电子表格。与国标23527-2009 蛋白酶制剂和国标34800-2017 蛋白酶K酶活力及杂质检测方法相比，本方法有以下更新：当制备酪蛋白溶液时，水浴加热的步骤被删除并改为磁力搅拌器加热；表明福林试剂的特定浓度为1摩尔/升；规定校准移液管用于测量和准备

10、福林试剂曲线；详细解释了样品的稀释方法；增加了三氯乙酸的量将紫外分光光度法与福林法的推荐比值提高了1.50-1.80。2.主要指标介绍(1)样本选择了四家制造商提供的六个蛋白酶样品进行方法验证。通过预实验获得以下目标酶活性。表1样品的酶活性样本号产品名称福林法预测酶活性单位/克或单位/毫升紫外法预测酶活性单位/克或单位/毫升估算方法比率(紫外线法：福林法)1样本14500007800001.732样本24600007100001.543样本32900004900001.684样本41500002600001.735样本56000009800001.636样本61900003100001.63注

11、：实验期间样品在4冷藏。(2)基底的处理规定了底物酪蛋白的制备过程，更加具体直观。详情如下：底物酪蛋白在加热时可溶于水，因此在搅拌过程中缓慢加热并溶解。注意加热时间，避免煮沸引起蛋白质变性。完全溶解并冷却后，调节酸碱度至10.5，并将其放入100毫升容量瓶中。更新后的制备方法取消了水浴加热，增加了磁力搅拌加热方法，减少了人工搅拌过程，直接加热方法也加快了试剂制备时间，更具可操作性。此方法指的是起草单位的内部处理方法。(3)样品处理酶制剂可分为固体制剂和液体制剂。对于不能完全溶解在均匀介质中的固体制剂，制定以下稀释制剂规定更加具体和直观：除主要成分外，固体酶还包括淀粉、无机盐、有机物质、水不溶性

12、物质等。因此，有些固体酶不能完全溶解在均匀稳定的水溶液中，因此规定了具体的制备方法。在更新后的制备过程中，增加了样品的溶出度方法，并对酶样品和溶出液进行精确称量，记录数据，便于后续稀释倍数的测定；样品溶解并搅拌15分钟以上，在离心机(4000转/分钟)中离心5分钟，得到均匀无杂质的酶溶液，确保酶活性准确稳定。不同样品处理方法之间无明显差异，结果见表2。表2样品处理方法的比较滤纸过滤和离心分离的区别样品滤纸过滤以4000转/分钟的速度离心5min平均活性单位/毫升变异系数%2号样品2056002152002104003.23样品稀释比较样品考虑定容容量瓶平均活性单位/克变异系数%6号样品1960

13、001877001918503.06(4)福林试剂标准曲线解决了福林试剂K值测定和曲线绘制中的问题a)左旋酪氨酸标准溶液制备方法的比较规定了不同浓度左旋酪氨酸标准溶液的制备方法，标准规定了福林试剂。福林法的k值应在95 100范围内，紫外法的k值应在130 135范围内，但只有用移液管配制的标准溶液的k值在规定范围内。结果如表3所示。表3制备左旋酪氨酸标准溶液的取样方法比较移液管波长/浓度g/mL01020304050k值275nm00.0750.1500.2300.3060.381130680纳米00.1020.2130.3200.4250.52694.38移液管275nm00.0790.1

14、520.2260.3030.379133680纳米00.1100.2110.3140.4200.51895.83b)测试结果的吸光度值与规定的曲线范围之间的差值由于紫外试验中先导剂量的变化，计算公式发生变化，因此建议转移酶活性的稀释范围，并做如下试验比较。曲线上不同范围内测试结果的吸光度值没有显著差异，结果如表4所示。表4曲线上不同范围的比较不同稀释范围的对比测定(紫外法)在40下进行10分钟样本/曲线范围酶活性单位/克(毫升)标清变异系数%0.193-0.3840.110-0.219活动平均值样本1693200659500676400238293.52样本425560025150025360

15、028991.14样本61002200954400978300338003.453.方法验证通过方法论的研究，该方法得到了如下验证：L- t的制备方法样品的稀释方法：容量瓶法和分析天平称量法没有明显区别；样品的处理方法：滤纸过滤和离心对酶活性影响不大；法的精密度为3%。4.福林法和紫外分光光度法验证结果(1)实验介绍福林法是在碱性条件下，用福林试剂还原蛋白酶水解产物，生成钼蓝和钨蓝，并在680纳米分光光度计上测定其吸收值；在紫外法中，水解后产生的酪氨酸用紫外分光光度计在275nm处测定。方法上的区别只是过滤后是否加入福林试剂。它们之间有一定的比例关系，具体比例由实际样品决定。为了研究该方法的适用性，选择了以下酶制剂作为实验样品，这些样品由行业中具有代表性的四家制造商确定。由于环境、人为、试剂制备、方法理解等多种因素的影响。四个制造商中的两个制造商的样品的酶活性测量数据可用。因此，以下方法验证仅比较和分析这两个制造商。详见附件1。(2)紫外分光光度法与福林法的比值分析表5方法比率活动表样品单位/克(单位/毫升)企业1企业2紫外线法福林方法比例紫外线法福林方法比例样本17781794505891.736710734162271.61样本27124674597151